På genjagt i husdyrene: Fra fænotype til genotype

Bo Thomsen, Seniorforsker (bo.thomsen@agrsci.dk), og Christian Bendixen, Forskningsprofessor, (christian.bendixen@agrsci.dk), Afdeling for Genetik og Bioteknologi, Danmarks JordbrugsForskning.

Darwin skriver i Arternes Oprindelse: ”Det er derfor af største vigtighed at få en klar forestilling om de måder, hvorpå organismerne modificeres og deres levevis lempes efter forholdene. Da jeg begyndte mine iagttagelser, forekom det mig sandsynligt, at et omhyggeligt studium af husdyrene og de dyrkede planter var det, der nærmest vilde hidføre en løsning af denne dunkle opgave. Jeg blev heller ikke skuffet; i dette og alle andre vanskelige tilfælde har jeg fundet, at vort kendskab til husdyr og dyrkede planter, hvor ringe det end er, dog altid er den bedste og sikreste ledetråd. Så endskønt den art af studier i almindelighed er bleven meget forsømt af naturforskerne, vover jeg dog at vedkende mig det som min overbevisning, at man ikke noksom kan lægge vægt herpå.”

Darwin blev stærkt inspireret til sin teori om evolution af nye arter gennem naturlig selektion ved iagttagelser af den enorme fænotypiske variation hos husdyr, som kan opnås gennem avl. Husdyrene udgør et skatkammer af genetisk og fænotypisk variation, der kan udnyttes til at afsløre gener med betydning for stofskiftet, vækst, stress, ernæring, immunsystemet, vært-patogen interaktion, adfærd og arvelige sygdomme med relevans for human sundhed (Andersson, 2001). Genetisk forskning har i de seneste år stærkt forbedret vores kendskab til husdyrenes genomer (Wernersson et al., 2005), og vi står i dag bedre rustet end nogensinde til at udforske den molekylære basis for fænotypisk variation hos husdyr. Formålet med forskningen er ofte at udvikle diagnostiske DNA test for favorable egenskaber, således at denne information kan inkorporeres i det praktiske avlsarbejde, men det er dog ligeså væsentligt, at forskningen skaber ny grundlæggende indsigt i genernes funktion og hermed øget forståelse af fænotypen.

Multigene egenskaber

I husdyrbruget foretages løbende fænotypiske registreringer af en lang række produktions- og sundhedsegenskaber. Ved at kombinere disse data med genotype-bestemmelser af dyrene er det muligt at identificere, hvilke gener, der spiller en rolle for den fænotypiske variation i egenskaberne. Ved Danmarks JordbrugsForskning gennemføres omfattende genom-scanninger i både kvæg og svin, hvilket har resulteret i genetisk kortlægning af gener, som kontrollerer en lang række kvantitative træk, herunder resistens mod infektionssygdomme som for eksempel lungebetændelse hos svin eller yverbetændelse hos kvæg. Kvantitative egenskaber er kontrollerede af et samspil mellem mange gener, hvilket giver komplicerede genotype-fænotype relationer. Dette vanskeliggør bestemmelsen af den nøjagtige kromosomale position af de effektgivende varianter, og de nuværende DNA test er derfor baserede på koblede markører.

Når mutationer spredes globalt: Complex Vertebral Malformation (CVM)

Figur 1. Syge kalve med Complex Vertebral Malformation nedstammer fra Carlin M Ivanhoe Bell.

Særlig fokus har været rettet mod identifikation af arvelige mutationer for at hindre disses udbredelse. Alle organismer er bærere af recessive mutationer, der ville være letale, hvis ikke gendefekterne opvejedes af et normalt arveanlæg. Ved parring mellem beslægtede individer forøges risikoen for, at en recessiv mutation fra en fælles forfader ender op i et afkom i homozygot tilstand. Hos kvæg er indavl et voksende problem som følge af den udbredte brug af relativt få avlstyre samt selektion af de bedste individer fra tyrefamilien til videre avl. I 1999 blev man opmærksom på, at der fødtes et stigende antal vanskabte kalve med særlige karakteristika hos sortbroget malkekvæg i Danmark. De fleste kalve var dødfødte og havde iøjnefaldende defekter så som stærkt misdannede ryghvirvler, hvilket gav sygdommen navnet Complex Vertebral Malformation. Andre kendetegn var stivhed og rotation af fodledene på alle fire ben, og mange kalve havde desuden defekter i varierende grad i forskellige indre organer, først og fremmest hjertet. Ved at granske kalvenes stamtavler (Figur 1) fandt vi, at alle syge kalve nedstammede fra en bestemt tyr, Carlin-M Ivanhoe Bell (Figur 2). Denne observation var stærkt foruroligende, fordi Carlin-M Ivanhoe Bell på daværende tidspunkt have været anvendt som avlstyr i to årtier i hele verden og derved var blevet stamfar til millioner af malkekøer på verdensplan.

Figur 2. Carlin M Ivanhoe Bell er en international elitetyr. Han optrådte således i 2001 mere end 707.000 gange i stamtræerne fra de ca. 920.000 danske sortbrogede køer. Hos enkelte dyr optrådte Bell mere end 5 gange i stamtræet og der er således rig adgang til studier af de genetiske defekter han måtte bære på.

Vi har for nyligt demonstreret, at CVM skyldes en mutation i genet SLC35A3 (Thomsen et al., 2006). Genet koder for en nukleotid-sukker transporter, der er ansvarlig for optagelsen af UDP-N-acetylglucosamin i Golgi apparatet. I Golgi bruges nukleotid-sukker molekyler i forskellige glycosyleringsreaktioner, og da mutationen i SLC35A3 ødelægger optagelsen af UDP-N-acetylglucosamin i Golgi, medfører dette et højst unormalt glycosyleringsmønster af en lang række proteiner i vævet hos CVM-kalvene.

Kalvenes fænotype har fælles træk med to forskellige humane sygdomme, nemlig Alagille og spondylocostal dysostosis, der skyldes mutationer i Jagged og Delta liganderne. Disse ligander deltager i Notch signal-transduktion, hvilket er en mekanisme, som tillader celler at kommunikere med hinanden. Signal-overførelsen mellem liganderne og Notch receptoren er afhængig af glycosylering af Notch. Glycosyleringen udføres af glycosyltransferasen Fringe i Golgi apparatet i en reaktion, der bruger UDP-N-acetylglucosamin som substrat. Mutationen i SLC35A3 forhindrer optagelsen af UDP-N-acetylglucosamin i Golgi, hvilket sandsynligvis hæmmer glycosyleringen af Notch receptoren. Notch signal-transduktion regulerer dannelsen af ryghvirvlerne via et mellemstadium, der kaldes somiter. Årsagen til de misdannede ryghvivler hos CVM-kalvene og mennesker med Alagille eller spondylocostal dysostosis er, at somit-dannelsen er obstrueret.

Frekvensen af bærere af CVM-mutationen nåede 20-30 % i mange lande, hvilket placerede CVM blandt de mest udbredte og hyppigst forekommende arvelige sygdomme blandt husdyr i verden. I dag undersøges alle avlsdyr for tilstedeværelsen af CVM mutationen ved brug af en test, der er beskyttet af et internationalt patent (WO0240709A2), og udbredelsen af mutationen er nu bragt under kontrol.

En dyremodel for dværgvækst

Der er hos mennesker identificeret en række sygdomsgener, der er årsag til dværgvækst. Et af disse er COL10A1, der koder for collagen type X, og som ved mutation resulterer i sygdommen Schmid metaphyseal chondrodysplasia, SMCD. Man har tidligere forsøgt at udvikle en dyremodel for SMCD ved genetisk manipulation af mus, men disse var stort upåvirkede af manglen på collagen type X og viste kun svage tegn på deformiteter, der mindede om SMCD. Vi har identificeret en dominant mutation i COL10A1, som årsag til dvægvækst hos grise (Figur 3). Histologiske undersøgelser af knoglestrukturen hos grisene viste patologiske forandringer i lighed med dem, der observeres i SMCD. Kondrocyternes normale differentiering var tydeligt påvirket i vækstpladen, hvor især den hypertrofe zone var kraftigt ekspanderet på grund af mangelfuld degeneration af de hypertrofe kondrocyter. Disorganiserede kondrocyter og bruskretentioner i metafysen var også typiske forandringer. Observationerne viser, at dværggrisene er en gyldig dyremodel, som har forøget vores indsigt i collagen type X’s rolle i knoglevækst og den har dermed bidraget til en bedre forståelse af årsagen til dværgvækst hos individer bærende COL10A1 mutationer (Nielsen et al., 2000).

Figur 3. To helsøskende, hvor grisen til højre bærer en dominant mutation i COL10A1.

Gendefekt årsag til dårlig sædkvalitet

I visse populationer af Yorkshire svin findes en arvelig sygdom, som gør ornerne sterile. Sygdommen kaldes Immotile Short Tail Sperm (ISTS), og den er karakteriseret ved, at 9+2 strukturen i axonemet i spermatozoernes haler er defekt. I samarbejde med MTT Agrifood Research Finland har vi identificeret genet og mutationen, der forårsager ISTS-fænotypen. Det er en insertion af en L1 retrotransposon i KPL2, som resulterer i unormal mRNA splicing, hvorved den åbne læseramme i KPL2 transkriptet brydes (Sironen et al., 2006). Kpl2-proteinets cellulære rolle er ukendt, men dets funktion i cilier/flageller synes at være bevaret gennem evolutionen.  KPL2 er således homologt til CPC1 fra den encellede organisme Chlamydomonas, og det er bemærkelsesværdigt, at mutationer i CPC1 resulterer i defekte flageller.

Nye kandidatgener for neurologiske sygdomme

Figur 4. Myelinskader bevirker, at kalvene fra fødslen er ude af stand til at rejse sig. (foto: J.S.Agerholm, KVL)

Medfødt lammelse er en neurologisk sygdom, der forekommer i Rød Dansk Malkerace. Sygdommen skyldes en enkeltgens-defekt med autosomal recessiv arvegang, og lammelsen er forårsaget primært af mangelfuld myelindannelse i rygmarven, men også i nogen grad på grund af nedbrydning af allerede dannet myelin. Vi har ved genomscanning kortlagt sygdomsgenet til en 2-3 cM region på kromosom 11, hvilket førte til udvikling af en markør-baseret genetisk test og sygdommen er i dag stort set elimineret fra kvægpopulationen (Nissen et al., 2001). Identiteten af selve sygdomsgenet er endnu ikke fastslået. Dette skyldes, at sekventeringen og annoteringen af det bovine genom ikke er helt afsluttet i det pågældende kromosomområde, og da regionen endvidere udgør et evolutionært breakpoint, er der usikkerhed om, hvilke gener, der ligger i den relevante region. Omvendt synes det dog klart, at området ikke indeholder nogen af de kendte neurologiske sygdomsgener, hvilket betyder, at en fremtidig identifikation af sygdomsgenet for medfødt lammelse vil afsløre ny viden om gener, der er involveret i myelindannelsen i centralnervesystemet.

Litteratur

Andersson, L. Genetic Dissection of phenotypic diversity in farm animals. Nature Reviews Genetics 2, 130-138 (2001)

Bendixen, C., Svendsen, S., Jensen, H., Panitz, F., Aasberg, A., Holm, L., Horn, P., Høj, A., Thomsen, B., Jeppesen, M., Nielsen, V.H., Jonker, M. Genetic test for the identification of carriers of complex vertebral malformations in cattle. Patent WO0240709A2.

Darwin, C. Arternes oprindelse ved kvalitetsvalg eller ved de heldigst stillede formers sejr i kampen for tilværelsen. Anden udgave 1909. Gyldendalske Boghandel, Nordisk forlag, København.

Nielsen, V.H., Bendixen, C., Arnbjerg, J., Sørensen, C.M., Jensen, H.E., Shukri, N.M., and Thomsen, B. Abnormal growth plate function in pigs carrying a dominant mutation in type X collagen. Mamm. Genome 11, 1087-1092 (2000)

Nissen, P.H., Shrukri, N.M., Agerholm, J.S., Fredholm, M., and Bendixen, C. Genetic mapping of spinal dysmyelination in cross-bred American Brown Swiss cattle to bovine Chromosome 11. Mamm. Genome 12, 180-182.

Sironen, A., Thomsen, B., Andersson, M., Ahola, V., and Vilkki, J. An intronic insertion in KPL2 results in aberrant splicing and causes the immotile short-tail sperm defect in the pig. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 5006-5011 (2006).

Thomsen, B., Horn, P., Panitz, F., Bendixen, E., Petersen, A.H., Holm, L., Nielsen, V.H., Agerholm, J.S., Arnbjerg, J., and Bendixen, C. A missense mutation in the bovine SLC35A3 gene, encoding a UDP-N-acetylglucosamine transporter, causes complex vertebral malformation. Genome Res. 16, 97-105 (2006)

Wernersson, R., Schierup, M.H., Jorgensen, F.G., Gorodkin, J., Panitz, F., Staerfeldt, H.H., Christensen, O.F., Mailund, T., Hornshoj, H., Klein, A., Wang, J., Liu, B., Hu, S., Dong, W., Li, W., Wong, G.K., Yu, J., Wang, J., Bendixen, C., Fredholm, M., Brunak, S., Yang, H., Bolund, L. Pigs in sequence space: A 0.66X coverage pig genome survey based on shotgun sequencing. BMC Genomics 6, 70 (2005)