Antrax i biologisk krigsførelse

Gert Bolander Jensen, kemiingeniør, Ph.D., Arbejdsmiljø-instituttet, gbj@ami.dk

Biologisk krigsførelse i et historisk perspektiv

Mennesker har altid udnyttet de tilgængelige teknologier til at såvel gavnlige som destruktive formål. Allerede primitive folkeslag som den Sydamerikanske urbefolkning brugte curare og toksiner fra giftige frøer og andre paddedyr i forbindelse med jagt og stammekrige. Moderne forsøg på at lave våben af biologiske toksiner er desværre blot en naturlig konsekvens af denne stenalder-teknologi.

Allerede under belejringen af Kaffa i 14-tallet blev de angribende Tatarere ramt af en pest-epidemi. Tatarerne forsøgte at ændre slagets gang ved at anvende katapulter til at slynge ligene af de døde ind i byen Kaffa. En epidemi i byen fulgte. (Det er dog også sandsynligt, at Kaffa ville have oplevet epidemien alligevel, da lopperne, der oftest er smittebærere, hurtigt forlader den døde for at søge levende værter. Dette taler for, at andre smitteveje, såsom rotter, mus og andre gnavere og deres parasitter kan have fungeret som smittebærere)

I 1763 foreslog Sir Jeffrey Amherst, kommandør over de Britiske tropper i Nordamerika, en bevidst anvendelse af kopper for at reducere antallet af indianere. Et udbrud af kopper i Fort Pitt, dannede baggrunden for udførelsen af Amherst’s plan. Den 24 juni 1763, uddelte kaptajn Ecuyer, en af Amherst’s underofficerer, tæpper og et lommetørklæde fra koppe-hospitalet til indianere, og noterede i sin journal: "Jeg håber dette vil have den ønskede effekt". Virkningen var ikke at disse indianere skulle have det behageligt i løbet af vinteren. Snarere var det at bruge koppevirus som biologisk våben overfor et stammefolk, der praktisk talt ikke har noget immunforsvar forberedt på dette. Planen virkede tilsyneladende, over 100.000 mennesker i Ohio River Valley, Delaware, Mingo og andre steder døde som følge af en koppe-epidemi de efterfølgende år.

I forbindelse med krige, har erkendelsen af betydningen af infektiøse sygdomme resulteret i brugen af afføring, dyre-kadavere og lig til at forurene brønde og andre vandreservoirer. Således anvendte vietcongerne, under Vietnamkrigen 1960’erne, såkaldte pungi-sticks, spidse bambuspinde smurt ind i afføring som en del af deres guerillakrigsførelse.

I Oregon i 1984, var en indisk guru og hans gruppe af disciple så opsat på at vinde det lokale valg til bystyret, at de aftenerne før valget, besøgte lokale restauranter og i al hemmelighed forgiftede buffeterne med Salmonella-bakterier. 751 mennesker blev syge med opkastning og diarre. Guruen og hans disciple vandt ikke valget, men det tog næsten et år at få opklaret, hvad der var sket, og hvem der stod bag forbrydelsen [1].

Indenfor biologisk krigsførelse er en af de foretrukne mikroorganismer bakterien Bacillus anthracis også kaldet miltbrand-bakterien. Slægten Bacillus er kendetegnet ved at være en Gram-positiv, stavformet og sporedannende bakterie. Bacillus anthracis er nem at opformere da der ikke er synderligt specifikke substratkrav, og en udgæret kultur vil som oftest bestå af sporulerede bakterier i koncentrationer på milliarder af sporer per milliliter substrat. Ved inhalation er den dødelige dosis for mennesker ukendt, men er fundet at være ned til 4000 sporer i studier med primater[2]. Dette, i kombination med den relativt nemme fremstillingsmåde, har gjort, at biologiske våben baseret på blandt andet Bacillus anthracis er blevet kaldt "den fattige mands atombombe".

Miltbrand (Antrax)

Miltbrand er en sygdom, der primært angriber planteædere, men kan inficere mennesker, der håndterer uld, huder, ben eller kadavere af inficerede dyr. Sygdommen, der også kaldes Antrax, er opkaldt efter det græske ord for kul, hvilket skyldes at symptomerne ved hud-miltbrand er en blære, der brister og danner et sår, som danner en kulsort sårskorpe (se figur 1). Tidligere blev sygdommen derfor også kaldt kulbrandbyld.

Figur 1. Eksempel på hud-miltbrand

Mennesker smittes gennem huden (hud-miltbrand), ved maveinfektion (tarm-miltbrand) og ved indånding (lunge-miltbrand).

Miltbrand er en af de ældste zoonoser beskrevet. Allerede Homer beskriver i Iliaden (1. sang) at guden Apollo sendte et pest-angreb mod den græske hær, efter at Apollons præst Khryses forgæves er kommet til grækernes lejr for at købe sin datter fri af fangenskab: "Først antasted hans Piil kun Muler og hurtige Hunde, Derpaa han skjød mod Folkene selv, og Pilen den hvasse Traf, og mangfoldige Dødningebaal der brændte bestandig." I Anden Mosebog (9:9) beskrives kvægpest (miltbrand) som en af Egyptens ti plager. Der findes beskrivelser fra middelalderen om hærgende epidemier af miltbrand i Europa og i det 17. og 18. århundrede blev det sydlige Europa ofte ramt af miltbrand-epidemier, der gjorde store indhug i både befolkninger og kvægbestande.

Historien om Bacillus anthracis

I 1863 påviste den franske parasitolog Casimir-Joseph Davaine at stavformede Baciller var årsag til miltbrand. Ved at indpode blod fra syge dyr på sunde, kunne sygdommen overføres, og dermed fik man det eksperimentelle bevis for sygdommens natur og smitteevne.

På det tidspunkt vidste man imidlertid ikke at bakterien var i stand til at danne sporer, en egenskab, der først blev påvist af tyskeren Robert Koch i 1876 ved en række meget elegante forsøg, der fik en af datidens førende patologer Julius Cohnheim til at udtale "Dette efterlader intet yderligere at bevise. Jeg betragter dette som den største opdagelse nogensinde angående bakterier"

I 1877 tog Louis Pasteur opgaven med at producere en vaccine op i Frankrig - og i 1881 afsluttede han et eksperiment, der blev verdenskendt: den 2. juni 1881 kunne Pasteur i Pouilly-le-Fort demonstrere at et stort antal dyr vaccineret med varmebehandlede bakterier overlevede, mens ikke-vaccinerede dyr døde, da de blev udsat for Bacillus anthracis. Disse opdagelser lagde grundstenen til den moderne forskning indenfor mikrobiologi og immunologi.

Praktisk taget alle dyr er følsomme overfor Bacillus anthracis. Planteædende dyr som kvæg, får, geder og muldyr er de hyppigst angrebne, oftest på grund af græsning på kontaminerede græsgange. Disse steder findes, ifølge visse teorier, på såkaldte "udklækningssteder". Dvs. lavtliggende områder, hvor kraftige regnskyl, høj pH-værdi i jorden (>6) samt temperaturer over 15°C fører til nedbrydning af græs og andre plantedele. I sådanne "udklækningssteder" undergår Bacillus anthracis mangfoldiggørelse i form af germinering, vækst og sporulering. Andre teorier anfører, at såvel massefylden som det faktum, at Bacillus anthracis sporer er hydrofobe gør, at sporerne føres med vandstrømmene i forbindelse med kraftige regnskyl til lavere liggende områder, hvor der således sker en opkoncentrering. Eftersom sådanne områder udgør det naturlige reservoir for Bacillus anthracis, der således ikke er afhængig af en værtsorganisme, kan bakterien ikke umiddelbart udryddes fra et område, og endemiske udbrud ses således i mange lande.

Bacillus anthracis sporer er langtidsholdbare

Bacillus anthracis sporer kan overleve længe i naturen. I forbindelse med arkæologiske udgravninger i Kruger National Park i Sydafrika i 1970, kunne B. anthracis sporer genoplives fra materiale, der blev kulstof-14 dateret til at være ca. 200 år gammelt. Tilsvarende er B. anthracis sporer præpareret af Louis Pasteur i 1888 fundet levedygtige i 1954, 68 år senere. Man mener i øvrigt at Sydafrika er oprindelsesstedet for Bacillus anthracis, idet man her finder den største naturlige diversitet af arten [3].

På den skotske ø Gruinard Island, detonerede man i 1942-43 adskillige bomber med B. anthracis sporer, og 40 år efter var øen stadig så kontamineret at man måtte desinficere de øverste 10-15 cm jordlag med formaldehyd for at fjerne levedygtige sporer. Herefter satte man får ud på øen for at undersøge effektiviteten af desinfektionen [4].

To plasmider gør Bacillus anthracis patogen

Figur 2 virulensplasmiderne i Bacillus anthracis

Bacillus anthracis har nogle nære slægtninge inden for den bakterielle verden nemlig madforgiftnings­bakterien Bacillus cereus og den insektpatogene bakterie Bacillus thuringiensis. Slægtskabet er så tæt, at flere har foreslået, at disse tre bakterie­arter skulle henføres til en og samme art; Bacillus cereus. De egenskaber, der adskille disse nære slægtninge, er alle plasmidkodede. Bacillus thuringiensis er således blot en Bacillus cereus udstyret med et plasmid, der gør bakterien i stand til at udtrykke såkaldte insekticidale krystal-toksiner, der kan slå f.eks. sommerfugle-larver eller mygge-larver ihjel, alt afhængig af hvilket plasmid bakterien indeholder.

Bacillus anthracis indeholder to såkaldte virulensplasmider, pXO1 og pXO2, der er henholdsvis 182 kbp og 93 kbp. Plasmid pXO1 er ansvarlig for udtrykkelsen af toxiner og plasmid pXO2 er ansvarlig for udtrykkelsen af overfladeproteiner (se figur 2). Mister bakterien et eller begge plasmider, vil den ikke længere være patogen. Dette er i øvrigt baggrunden for vaccinen som Pasteur fremstillede i 1881, idet denne bakterie ikke indeholdt plasmidet pXO1. Denne vaccine er dog ikke så kraftig immunogen som vaccine-stammen, der ikke indeholder pXO2 (den såkaldte Sterne-stamme, isoleret af Sterne  i 1937), idet tilstedeværelsen af toksiner har en kraftig immunogen effekt (se figur 2). Det antydes, at Pasteur rent faktisk arbejdede med en forurenet kultur af Bacillus anthracis som vaccine, hvilket nogle gange bevirkede at dyr døde af vaccinen. Pasteur skulle således til en konference i 1881 spontant have udbrudt "C’est une grande progress, Messieur!" til Robert Koch, da denne viste teknikken vedrørende udstrygning af bakterier til enkeltkolonier.

Antrax-toksinets virkemåde

Toksinet består af tre proteiner. Protective Antigen (PA) binder til værtscellens membran. En protease på overfladen af bakteriecellen spalter et 20kDa protein fra PA, og eksponerer derved et sekundært bindingssted, hvor henholdsvis Lethal Factor (LF) og Edema Factor (EF) kan bindes. Protein-komplekserne (hhv PA+LF og PA+EF) flyttes til værtscellens indre, hvor de udfører deres katalytiske funktion (se figur 3)

Beskyttende immunitet mod antrax kræver antistof-dannelse mod nogle af antrax-toxinet komponenter. Der findes human vacciner baseret på toksiner alene og animalske vacciner baseret på levende sporer, der kun udtrykker toksiner. Begge vacciner giver beskyttelse ved at fremkalde antistoffer mod det såkaldte "protective antigen"

Den cellulære kapsel i Bacillus anthracis er ikke nævneværdig immunogen, og antistoffer mod denne eller andre cellevægs-komponenter er ikke beskyttende.

Ved indånding af antrax-sporer, der har størrelser på 1-3 µm, vil disse blive angrebet af immunsystemets makrofager.

Figur 3 antrax-toksinets virkemåde (se tekst for forklaring)

Kapslen, der omgiver  bakterien menes at beskytte mod fagocytose, og medvirker således til virulensen af Bacillus anthracis. Inden i makrofagerne germinerer sporen, der samtidig bringes til lymfeknuder, og herfra spredes til andre organer via blodet. Bakteriekoncentrationen kan blive op til 10⁶-10⁸ per ml., men selvom det er muligt at slå bakterieinfektionen ned på dette tidspunkt, vil det ofte være for sent, idet antrax-toksinet herefter vil udøve sin virkning, og slå personen ihjel. De typiske tegn er et par dage med forkølelses-lignende symptomer, der pludseligt slår over i et akut forløb med smerter i hoved, brystkasse og mellemgulv. Personen vil i dette forløb dø indenfor 24 timer på trods af behandling [5].

Udslip fra biokemisk våbenfabrik i Uralbjergene

På trods af, at Sovjetunionen allerede i 1972 underskrev traktaten vedrørende forbud mod udvikling, produktion og opmagasinering af biologiske våben, fandt et usædvanligt udbrud af miltbrand-tilfælde sted i Sverdlovsk (nu Jekaterinburg) på østsiden af Uralbjergene i Sovjetunionen i april 1979. En  publikation i 1980 tilskrev dette udbrud hud og maveinfektioner der stammede fra fortæring af Bacillus anthracis-forurenet kød [6]. Militærlægen general P. N. Burgasov drog til USA for at berolige Vesten og formidle resultatet af  Bezdenezhnykhs og Nikiforovs undersøgelser. Udbruddet fik dog stor vestlig bevågenhed, idet man tilskrev epidemien et udslip fra en militær mikrobiologisk forskningsinstitution - fabrik 19. Denne forskningsenhed var lokaliseret i den nordlige ende af en smal højrisiko-zone, hvor alle ofrene enten boede eller arbejde.

Epidemiologiske undersøgelser underbyggede stærkt antagelsen af et udslip fra forskningsenheden d. 2. april 1979, hvor mindst 42 mennesker døde [7]. Der var 9 kvinder og 33 mænd i alderen 25 til 71 år. Patientjournaler og ligsynsrapporter blev fjernet fra hospitalet af myndighederne. Hvad myndighederne ikke vidste var, at to videnskabsfolk, Faina Abramova og Olga Yampolskaya, var i besiddelse af noter, der beskrev indholdet af ligsynsrapporterne. Yderligere havde de paraffinindstøbte vævsprøver, præparater til mikroskopering, samt andre vævsprøver fra de 42 døde personer. Undersøgelser af disse prøver har nu vist, at det var Bacillus  anthracis, der var årsagen til de mange dødsfald, men yderligere har de to forskere fundet, at smittevejen ikke er ved indtagelse af fordærvet kød, men derimod skyldes inhalation af Bacillus anthracis-sporer [7-9]. En pensioneret russisk general har senere fortalt, at uheldet skyldtes at man i forbindelse med rengøringsarbejde ikke fik tilsluttet en sikkerhedsventil [10].

Frygt for miltbrand i Usbekistan

I  foråret 1988 blev sovjetiske mikrobiologer, i al hemmelighed, udkommanderet til Sverdlovsk for at fjerne flere tons Bacillus anthracis sporer – nok til at slå jordens befolkning ihjel adskillige gange.

Bakterie-sporerne blev overført til store rustfrie tanke, hvorefter klorholdige desinfektionsmidler blev tilsat for at uskadeliggøre sporerne. Beholderne blev sat på et godstog, der transporterede den hemmelige last tusinde kilometer gennem Sovjetunionen til grænsen mellem Usbekistan og Kasakhstan. Her, på øen Vozrozhdeniye i Aral-søen, blev indholdet fra tankene hældt i grave, overhældt med desinfektionsmidler igen og dækket med 1-2 meter jord.

I 1996, efter Sovjetunionens opløsning, blev de lokale myndigheder i Usbekistan og Kasakhstan enige om at give adgang til vestlige forskere. Amerikanske videnskabsfolk og efterretningsfolk har siden undersøgt området, og fundet, at i seks ud af 11 store nedgravninger var det muligt at isolere levedygtige Bacillus anthracis [11]. Dette til trods for at sporemængderne havde været behandlet med klorholdige desinfektionsmidler to gange.

Øen Vozrozhdeniye blev allerede i 1936 placeret under det sovjetiske forsvarsministerium på baggrund af studier, der i en rapport karakteriserede områdets varme og tørre klima som "..dette vil mindske spredningen og overlevelsen af patogene organismer". Vozrozhdeniye er således angiveligt blevet brugt som forsøgsområde og losseplads for det daværende Sovjets biokemiske våben fra 1954 til 1992. Aralsøen, hvor øen Vozrozhdeniye ligger, er en ca. 60.000 km² stor saltsø, men på grund af årtiers afledning af vand til ris- og bomuldsmarker i Kasakhstan og Usbekistan er søens areal nu formindsket med 40 % og har efterladt en saltørken, som breder sig. Øen Vozrozhdeniye er vokset fra oprindeligt 200 km² til 2000 km², og vil snart forbindes til fastlandet, hvilket vil forøge risikoen for at Bacillus anthracis sporer vil spredes til beboede områder.

Også Irak eksperimenterede med Bacillus anthracis

Irak, der også havde underskrevet traktaten vedrørende biologiske våben, har været under mistanke for at omgå denne. Efter golfkrigen, blev nedsat et udvalg i De forenede Nationers Specielle kommission (UNSCOM), der skulle kontrollere, hvorvidt Irak havde faciliteter, der kunne producere biologiske våben. Ifølge en resolution fra FN’s Sikkerhedsråd, blev de forbudt at have sådanne anlæg, og Irak forsikrede i april 1991, at de ikke havde våben baseret på biologiske krigsmidler. Irak tilsluttede sig yderligere en resolution, der tilkendegav, at man ikke havde intentioner om at udvikle biologiske våben. De skulle senere vise sig, at Irak på det tidspunkt var i besiddelse af 157 luftmissiler, og 25 sprænghoveder, der alle var fyldt med blandt andet Bacillus anthracis [12].

FN’s kommission sendte således i august 1991 eksperter i biologiske våben til Irak. På det tidspunkt erklærede Irak at de rent faktisk havde udført begrænsede forsøg med biologiske våben, men at disse forsøg var ophørt i 1990, og biologisk materiale havde ikke været produceret i større mængder  og havde ikke været indsat i missiler og sprænghoveder. Eksperterne var i tvivl om, hvorvidt Irak rent faktisk talte sandt, men kunne ikke komme med entydige beviser. Man besluttede sig til at være mere opsøgende og ikke kun lade sig nøje med at tro på skriftlig dokumentation, uden også at se faktiske beviser. Eksperterne stødte således på Al-Hakam fabrikken i september 1991. Man var allerede ved det første besøg overrasket over ikke blot størrelsen af fabrikken, men også de omfattende sikkerhedsforanstaltninger, der var truffet. Fabrikken lå i en øde ørken 60 km syd for Bagdad, og var omgivet af vagttårne og pigtråd i en omkreds på 3 x 6 km uden om fabrikken. Irak hævdede at fabrikken var et civil produktionsanlæg, der producerede single-cell proteiner (foderstof med højt proteinindhold bestående af enkeltceller af gær eller bakterier), samt at anlægget skulle producere et biopesticid baseret på en Bacillus thuringiensis bakterie [12,13].

Iraks påstande blev modsagt af mange fysiske kendsgerninger. Blandt andet indeholdt fabrikken et større staldanlæg, samt et forbrændingsanlæg til døde dyr. Yderligere var det umuligt at fremskaffe den økonomiske dokumentation for driften af anlægget.

Senere, i 1995, blev FN’s kommission opmærksom på, at Irak havde importeret 40 tons substrat til bakteriekulturer i slutningen af 1980. Kun omkring 17 tons kunne forklares ved industriel produktion.

I 1996 fik man igen adgang til Al-Hakam fabrikken. Alt udstyr var i mellemtiden rengjort og steriliseret, og man kunne derfor ikke finde nogen levende mikroorganismer på stedet. Det viste sig dog, at en pH-elektrode i et laboratorium ikke var blevet tilstrækkeligt rengjort, og ved hjælp af DNA-teknikker, kunne FN’s eksperter finde spor af biologiske våben. Med denne dokumentation, måtte Irak endelig indrømme, at de rent faktisk havde et program til udvikling af biologiske våben, samt at Al-Hakam fabrikken havde været et produktionsanlæg for biologiske våben. Men Irak nægtede fortsat at havde monteret biologiske våben på missiler og i sprænghoveder.

Undersøgelser viste, at allerede i 1985 havde Irak etableret en militært forskningsinstitution, der skulle udvikle biologiske våben. Dette blev gjort under et større forskningsprogram, der udviklede våben til kemiske krigsførelse. Kort tid efter etableringen af denne forskningsinstitution, blev den flyttet til en lille halvø sydøst for Bagdad. Her blev forsøg udført i mindre skala. Produktion og testning af giftvirkninger på dyr blev udført. Blandt de anvendte mikroorganismer var også Bacillus anthracis. Forsøg med sprænghoveder fyldt med den beslægtede bakterie Bacillus subtilis blev udført.

Det var denne gruppe af teknikere og videnskabsmænd, der i 1988-89 flyttede til det tophemmelige produktionsanlæg Al-Hakam. I 1991, fem måneder efter golfkrigen startede, var man således ved at teste effekten af stor-skala spredning og aerosoldannelse af disse mulige biologiske våben.

Stadig frygt for Irak og det tidligere Sovjetunionen

Fredsforskningsinstututtet SIPRI (Stockholm International Peace Research Institute) fastslår i deres årsrapport, at Irak stadig udgør en potentiel trussel med hensyn til udvikling af biologiske våben. UNSCOM’s efterfølger UNMOVIC (UN Monitoring, Verification and Inspection Commission) kan ikke følge op på UNSCOM’s undersøgelser, idet Irak ikke hat tiltrådt FN’s resolution, der giver ret til inspektion og kontrol af destruktion af biologiske våben.

Det tidligere Sovjetunionen, der officielt har medgivet, at de ikke her påbegyndt destruktionen af biologiske våben, har bedt om udsættelse af tidsfristerne. Dette har vakt en del bekymring, specielt set i lyset af, at Kasakhstan ikke har underskrevet traktaten vedrørende forbud mod udvikling, produktion og opmagasinering af biologiske våben. Kasakhstan er et af de områder i det tidligere Sovjetunionen, hvor udvikling, produktion og opmagasinering af biologiske våben angiveligt fandt sted.

Lande som Kina, Taiwan, Israel, Syrien og Iran er i dag under mistanke for at udvikle biologiske våben. Israel er sammen med Kasakhstan og flere afrikanske lande aldrig tiltrådt traktaten. I alt 32 lande har ikke underskrevet traktaten vedrørende biologiske våben.

Litteraturliste

1. Torok TJ, Tauxe RV, Wise RP, et al: A large community outbreak of salmonellosis caused by intentional contamination of restaurant salad bars.  JAMA 1997;278:389-395.
2. Watson A, Keir D: Information on which to base assessments of risk from environments contaminated with anthrax spores.  Epidemiol.Infect. 1994;113:479-490.
3. Smith KL, DeVos V, Bryden H, et al: Bacillus anthracis diversity in kruger national park.  J Clin Microbiol. 2000;38:3780-3784.
4. Manchee RJ, Broster MG, Stagg AJ, et al: Formaldehyde solution effectively inactivates spores of Bacillus anthracis on the scottish Island of Gruinard.  Appl.Environ.Microbiol. 1994;60:4167-4171.
5. Pile JC, Malone JD, Eitzen EM, et al: Anthrax as a potential biological warfare agent.  Arch.Intern.Med. 1998;158:429-434.
6. Bezdenezhnykh IS, Nikiforov VN: [Epidemiologic analysis of anthrax in Sverdlovsk].  Zh.Mikrobiol.Epidemiol Immunobiol. 1980;111-113.
7. Jackson PJ, Hugh-Jones ME, Adair DM, et al: PCR analysis of tissue samples from the 1979 Sverdlovsk anthrax victims: the presence of multiple Bacillus anthracis strains in different victims.  Proc.Natl.Acad.Sci U S.A 1998;95:1224-1229.
8. Abramova FA, Grinberg LM, Yampolskaya OV, et al: Pathology of inhalational anthrax in 42 cases from the Sverdlovsk outbreak of 1979.  Proc.Natl.Acad.Sci U S.A 1993;90:2291-2294.
9. Meselson M, Guillemin J, Hugh-Jones M, et al: The Sverdlovsk anthrax outbreak of 1979.  Science 1994;266:1202-1208.
10. Rich V: Anthrax in the Urals.  Lancet 1992;339:419-420.
11. Bozheyeva, G, Kunakbayev, Y, and Yeleukenov, D. Former Soviet biological weapons facilities in Kazakhstan: past, present, and future.  1999. Monteray institute of international studies, Center for nonproliferation studies. Chemical and biological weapons nonproliferation project.
12. Seelos C: Lessons from Iraq on bioweapons.  Nature 1999;398:187-188.
13. Davis CJ: Nuclear blindness: An overview of the biological weapons programs of the former Soviet Union and Iraq.  Emerg.Infect.Dis 1999;5:509-512.