DNA vaccination - fremtidens profylakse?

Publiceret Juli 1999

Historie

Siden Edward Jenner i 1796 foretog sit dristige men frugtbare experiment med at inoculere en ung dreng med ko-koppe virus, har vaccinologien udviklet sig drastisk i erkendelse af at forebyggelse utvivlsomt er den mest effektive terapi.

Sidste skud på stammen er udviklingen af DNA vaccination (genetisk vaccination, gen-vaccination) som er blevet kaldt "Den tredje vaccine revolution " (1).

Efter at en gær-forsker opdagede at man kunne transfektere gær direkte ved at bombardere kulturen med micro-partikler coatede med det ønskede gen indsat i et circulært DNA plasmid, blev teknikken i 1982 afprøvet i aber hvor man viste at plasmid Hepatitis B DNA injiceret intramuskulært gav udvikling af et specifikt immunrepons (2) mod HBsAg.

Efter 1993 hvor Margaret Liu fra MERCK demonstrerede beskyttende immunitet i mus efter influenza-gen DNA vaccination er en lang række proto-type vacciner rettet mod såvel mikrobiologiske pathogener som visse cancer-former blevet udviklet i et plethora af dyremodeller. Aktuelt publiceres der ~300 DNA vaccine studier årligt (figur 1). Danmark deltager aktivt i denne forskning.

Antallet af publicerede (MEDLINE) artikler omhandlende DNA vaccination
Figur 1: Antallet af publicerede (MEDLINE) artikler omhandlende DNA vaccination målt per år fra 1980-1998.

En del humane kliniske phase I/II afprøvninger af DNA vaccinerer er aktuelt i gang i USA, Europa og Asien. Forskingsfeltet har en egen webside: http://www.genweb.com/Dnavax/.

Hvad er DNA vaccination

Direkte DNA plasmid injektion i hud, muskel eller slimhinde hvorved antigen-præsenterende celler transformeres til expression og præsentation af det indkodede antigen hvilket inducerer et specifikt immunrespons med produktion af antistoffer, CD8+ killer celler, CD4+ helper celler, B og T memory celler samt specifikke cytokiner.

Biologi

Vaccine plasmiddet (figur 2) kan enten skydes ind i huden coated på mikroskopiske guldpartikler via gene-gun (figur 3), gives intamuskulært ved injektioneller applikeres direkte på nasal eller genital mucosa i buffer.

Et prototype DNA vaccine plasmid produceret i f.eks. E.Coli.
Figur 2: Et prototype DNA vaccine plasmid produceret i f.eks. E.Coli. Promoteren som oftest er en stærk konstitutiv viral (CMV virus) promoter sikrer initiering af expression. Det immunogene protein her indsat som komplet gen udtrykkes og secerneres eller sættes ind i celle membran (afhængigt af leader sekvens).

Dette stimulerer primært antistofdannelse. Minigenerne derimod indeholder kun et MHC-I restrictet CTL epitop. Man kan indbygge 10-20 af sådanne epitoper i et enkelt plasmid. Dette er yderst relevant ved HIV og malaria som udvikler mutationer i netop disse epitoper, hvorfor man må vaccinere med multiple af sådanne epitiop varianter for at opnå dækkende protektion. Ubiquitinerings signalet er indbygget for at targetere det udtrykte konstruct til proteasomet for immunologisk processing der er nødvendig for korrekt peptid-præsentation i MHC-1 complexer på APC cellens overflade.De immunostimulatoriske bakterielle DNA sekvenser udgør et co-stimulus. Det valgfrie cytokin er indbygget til polycistron expression ved egen promotor og guider den APC celle til at frigive de cytokiner der er ønskelige for netop at opnå den slags immunitet der beskytter overfor det givne pathogen.

Enkelte ganske få antigen-præsenterende celler i disse væv optager plasmiddet, udtrykker og præsenterer det indkodede. Da disse celler nu udtrykker fremmed protein primer de immunsystemet der reagerer ved at danne antigen specifikke plasmaceller med heraf følgende antistof-dannelse og/eller specifikke CD8+ killer celler som eliminerer alle celler udtrykkende immunogenet. 

Viser selektion af et enkelt viralt gen til fremstilling af det plasmid der enten kan injiceres intramuskulært eller skyders ind i huden langerhanske celler med en gene-gun.
Figur 3: Viser selektion af et enkelt viralt gen til fremstilling af det plasmid der enten kan injiceres intramuskulært eller skyders ind i huden langerhanske celler med en gene-gun. Figur fremstillet af Dana Burns Pizer.

Da cellen selv in vivo og in situ producerer det ønskede antigen (figur 4) sikres korrekt foldning, oligomerisering, post-translationel modification og disulfidbro dannelse. Dette muliggør DNA vaccination med Immunogener hvor protection er betinget af dannelse af antistoffer med konformationelle epitoper.

Viser de 2 måder antigenet kan præsenteres på efter expression
Figur 4: Viser de 2 måder antigenet kan præsenteres på efter expression enten som et solubelt korrekt foldet protein til stimulation af antistofdannelse samt som peptidfragmenter (epitoper) komplexbundet til MHC-I der præsenterer komplexet til Tcelle receptoren til stimulation af peptid specifikt CTL respons. Figur fremstillet af Dana Burns Pizer.

Da man kan indbygge multiple antigene proteiner i samme ell. flere samtidigt indgivne plasmider sikres at man kan vaccinere med flere varianter af samme protein (relevant ved HIV/Malaria hvor der er antigen variation). Ønskes et bredt Cytotoxisk T-Lymfocyt (CTL) respons mod et varia af MHC-I restrictede epitoper kan disse bygges ind som minigener (figur 2).

Protektion mod flere vira samt en tumor model ved samme DNA-plasmid indeholdende 10 forskellige epitoper indbygget som minigener er vist i mus.

Modulation af immunreponset er mulig ved at indbygge gener for diverse cytokiner i selve vaccine plasmiddet som en slags "genetisk adjuvans" således at dette udtrykkes i samme celle som immunogenet præsenteres af.

Man har således kunnet "styre" responset i Th1 retning (CTL respons) eller Th2 retning (antistoffer). Dette er giver mulighed for at guide immunresponset i den retning der korrelerer med klinisk protection for det givne pathogen.

At opnå et CTL medieret respons er vigtig, idet dette er af vital betydning ved elimination af viralt inficerede og oncogent transformerede host celler. Dette er ofte meget vandskeligt at opnå ved traditionelle protein-subunit vacciner.

Immunresponset kan yderligere forstærkes ved at indbygge såkaldte immunostimulatoriske sekvenser (ISS) som ofte er bakterielt DNA med bestemte nucleotid repeats (CpG øer). Ved endnu dels ukendte mekanismer er mammale immun-celler i stand til at reagere på bakterielt DNA som grundet disse CpG øer har et ændret methylerings mønster. Dette giver et co-stimulatorisk signal. Man kan finde vaccine plasmiddet i lymfeknuder i optil 3 mdr efter vaccination ved PCR.

De celler der udtrykker immunogenet bliver imidlertid immunologisk elimineret efter 3 uger, hvilket væsentligt mindsker risikoen for bi-effekter af accidentel chromosomal integration. Ingen autoimmun medieret patologi, anti-nucleare antistoffer (ANA) eller anti-DNA-antistoffer er endnu observeret efter DNA vaccination. Den store flexibilitet mht. valg af antigener, genetiske adjuvanser og hermed immun-modulation, samt muligheden for at rejse et polyvalent CD8+ CTL respons udgør de største fordele ved DNA vacciner

Fordele og ulemper

DNA vaccine teknologien indebærer en række unikke fordele:

  1. Generer både cellulært og humoralt immunitet
  2. Simpel billig udvikling af plasmid vs. kompliceret oprensning af protein
  3. Vaccinen kræver ikke nedkøling, kan frysetørres.
  4. Polyvalens mulig
  5. Mucosa respons, IgA mulig
  6. Modulerbart immunrespons via specifik cytokin co-expression

Potentielle ulemper:

  1. Chromosomal plasmid integration mulig
  2. Auto-immunitet mulig
  3. Boost nødvendig

DNA vacciner i dyremodeller

For en række pathogener er der demonstreret varierende grader af protektiv immunitet i optil flere dyremodeller . Dette gælder ligeledes HIV-1 (15,16) hvor man har opnået protektion i Chimpanzer med DNA vaccination. Dette har motiveret os til at forsøge at udvikle en profylaktisk DNA vaccine primært rettet mod HIV-1 (11-14).

Det har imidlertid vist sig at være nemmere at stimulere et solidt respons i de små dyremodeller såsom mus og rotter, mens det i større dyr såsom grise, aber og mennesker er noget mere problematisk. Årsagen til denne sammenhæng er endnu ikke klarlagt.

En summarisk liste over de hidtil anvendte dyremodeller er angivet i tabel 1.

Tabel 1: Dyrestudier af DNA Vacciner rettet mod infektioner

Pathogen:

Antigener:

Species:

Borrelia (Lyme) OspA Mus
Bovine Herpesvirus Glycoprotein Kvæg; Mus
Cytomegalovirus ppUL83 Mus
Encephalitis virus prM/E Mus
FIV virus Entire FIV genome Katte
Hepatitis B Virus Envelope/HBsAg Chimpanzer; Mus; Kanin;Rotte
Hepatitis C Virus Core/Nucleocapsid/E2 Mus
Herpes Simplex Glycoprotein B;D,ICP27 Mus; Marsvin
HIV- Varia gener Mus; aber; Chimpanzer
Influenza Virus Hemagglutinin; Matrix protein; Nucleoprotein Kylling; aber Duer; Mus;
Leishmania major Major surface gp63 Mus
LCMV virus Glycoprotein; Mus
Measles Virus Nucleocapsid; HA Mus
Mycobacterium M. lepræ hsp65; Mus
Tuberculosis Antigen 85  
Mycoplasma pulm. Expression library Mus
Papillomavirus Major capsid protein L1 Kanin
Plasmodium yølii Circumsporozoite Mus
Prion Proteins Cellular prion (PRNP) Mus (PrP0/0)
Rabies Virus Glycoprotein Mus
Rotavirus Envelope; VP4, VP6 Mus
Schistosoma J Paramyosin (Sj97) Mus
SIV virus Env; Gag Aber
Tetanus Toxin Fragment C Mus
Toxoplasma Gondii p30 Protein Mus

for referencer: se http://www.genweb.com/Dnavax/Tables/infectious.html

Humane DNA vaccine trials

Da teknologien er ganske ny er der ingen humane phase IV efficacy trials publiceret endnu. Der er imidlertid udført en række (tabel 2) phase I/II trials som alle har konkluderet at DNA vaccination er sikker og uden uønskede bivirkninger samt at denne vaccinationsform inducerer relevant immunitet. Det fremtidige potentiale for denne meget modulerebare vaccinationsmåde der kan designes mod såvel infektions-sygdomme som neoplasmer kan formodentlig ikke overvurderes.

Tabel 2: Humane Studier: Igangværende phase I/II:

År

firma/forsker

target

Land

ref:

1995

Appollon/D.B Weiner/NIH

HIV inficerede

USA

(17)

1996

Univ. Alabama

CEA/colon cancer

USA

(10)

1997

PowderJect

Hepatitis B

USA

 

1997

Appollon/J. Ulmer

Influenza

Canada

(6)

1998

Vical/Pasteur/U.S.Navy

Malaria

USA

(4,5)

1998

B. Wharen, J. Hinkula

HIV inficerede

Sverige

(7)

1998

F. Stevenson

Malignt Lymphom

England

(3)

1998

Vical/Nat. Cancer Inst.

Melanom metastaser

USA

(8,9)

Referencer:

  1. Dixon, B. (1995) The third vaccine revolution. Bio/Technology 13, 420.
  2. Will, H. et al. (1982) Cloned HBV DNA causes hepatitis in chimpanzees. Nature 299:740-2
  3. Agadjanyan MG, et al. (1998) DNA plasmid based vaccination against the oncogenic human T cell leukemia virus type 1. Curr Top Microbiol Immunol 226: 175-192.
  4. Doolan DL, Hoffman SL. (1998) DNA vaccination as an approach to malaria control: current status and strategies. Curr Top Microbiol Immunol 226: 37-56.
  5. Wang R, Hoffman SL. (1998) Induction of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes in humans by a malaria DNA vaccine. Science 282:476-80
  6. Fu TM, Ulmer JB, Donnelly JJ (1999) Dose dependence of CTL precursor frequency induced by a DNA vaccine and correlation with protective immunity against influenza virus challenge. J Immunol 162:4163-70
  7. Calarota S, Hinkula J, Wahren B. (1998) Cellular cytotoxic response induced by DNA vaccination in HIV-1-infected patients. Lancet 351:1320-5
  8. Nawrath M, Mølling K. (1999) Reduced melanoma tumor formation in mice immunized with DNA expressing the melanoma-specific antigen gp100/pmel17. Leukemia 13 Suppl 1:S48-51
  9. Clay TM, Rosenberg SA, Nishimura MI. Changes in the fine specificity of gp100(209-217)-reactive T cells in patients following vaccination with a peptide modified at an HLA-A2.1 anchor residue. J Immunol 162):1749-55
  10. Phase Ia trial of a polynucleotide anti-tumor immunization to human carcinømbryonic antigen in patients with metastatic colorectal cancer. Comprehensive Cancer Center, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, Alabama. Hum Gene Ther. (1996) 7:755-72
  11. Vinner L, Nielsen HV, Bryder K, Corbet S, Nielsen C, Fomsgård A. Gene gun DNA vaccination with Rev-independent synthetic HIV-1 gp160 envelope gene using mammalian codons. Vaccine (1999) 17:2166-7
  12. Fomsgård A, Nielsen H, Bryder K, Nielsen C, Machuca R, Bruun L, Hansen J, Buus.S. Improved humoral and cellular immune responses against the gp120 V3 loop of HIV-1 following genetic immunization with a chimeric DNA vaccine encoding the V3 inserted into the hepatitis B surface antigen. Scand J Immunol (1998) 47:289-95
  13. Fomsgård A (1999) HIV-1 DNA vaccines. Immunol Lett 65:127-31
  14. Fomsgård A, Nielsen HV, Nielsen C, Johansson K, Machuca R, Bruun L, Hansen J, Buus S. Comparisons of DNA-mediated immunization procedures directed against surface glycoproteins of human immunodeficiency virus type-1 and hepatitis B virus. APMIS (1998) 106:636-46
  15. Robinson HL, Montefiori DC. et al.(1999) Neutralizing antibody-independent containment of immunodeficiency virus challenges by DNA priming and recombinant pox virus booster immunizations. Nat Med 5:526-34
  16. Boyer JD, Weiner DB et al. (1997) Protection of chimpanzees from high-dose heterologous HIV-1 challenge by DNA vaccination.Nat Med 5:526-32
  17. Ugen KE, Weiner DB. (1998) DNA vaccination with HIV-1 expressing constructs elicits immune responses in humans. Vaccine 16:1818-1821