Bacillus cereus – Dr Jekyll og Mr Hyde

Publiceret Juli 2005

Forrige år sad en lille belgisk pige og spiste en pastaret. Det blev hendes sidste måltid. I løbet af aftenen blev hun syg med mavesmerter, kvalme og opkastninger, og på trods af intensiv behandling døde hun tre dage efter af lever- og nyresvigt. Mikrobiologerne fandt efterfølgende store mængder af den samme bakterie i opkastet, i resterne af pastaretten og i hendes mave – bakterien hedder Bacillus cereus (B. cereus). På Arbejdsmiljøinstituttet har vi nu, i samarbejde med en belgisk forskningsgruppe, lokaliseret generne for det giftstof (toksin) som er ansvarlig for B. cereus’ sygdomsfremkaldende egenskaber. Det viser sig, at generne ligger på selvstændige DNA-molekyler, de såkaldte plasmider, på samme vis som de sygdomsfremkaldende egenskaber i miltbrandbakterien (B. anthracis) og i biopesticid-bakterien (B. thuringiensis). Det er disse plasmider, som afgør om bakterien er dødelig farlig for mennesker eller insekter eller om den kan spises som natur-medicin… og disse plasmider overføres flittigt mellem bakterierne i naturen.

Bakterien

Mange andre har været syge af B. cereus, men slap med dårlig mave og lidt mathed i sokkerne dagen efter. I Norge er B. cereus ansvarlig for en 1/3 af alle bakterielle mad-forgiftninger, mens det i Danmark kun er 5%. Men disse opgørelser er behæftet med megen usikkerhed, for kun få søger læge efter en enkelt dag med dårlig mave. B. cereus finder man overalt. Den er ofte beskrevet som en jordbakterie og hvor end man leder i naturen finder man den: i jord fra alle egne på Jorden, i krydderier og i tarmfloraen fra forskellige dyr. B. cereus er i stand til at danne meget modstandsdygtige sporer, der kan ligge i jorden i mange år og vente på gunstige betingelser for vækst. Det er også derfor, at B. cereus kan overleve kogning i forbindelse med madlavning og efterfølgende tage for sig af retterne uden konkurrence fra andre bakterier. De sygdoms­frem­kaldende egenskaber varierer meget mellem forskellige isolater af B. cereus. Det er antagelig kun et fåtal, der medfører alvorlig sygdom og mange er tilsyneladende ganske harmløse – der sælges sågar en række spiselige helseprodukter og probiotika (vækstfremmere til husdyr og produkter som skulle forbygge mave-problemer) baseret på tørrede B. cereus celler.

Hvordan kunne det så gå så galt for den lille belgiske pige? Et sammenfald af uheldige omstændigheder: der var tale om en særlig virulent (sygdomsfremkaldende) variant af B. cereus, pastaretten var ikke blevet opbevaret i køleskab, så bakterierne havde formeret sig og var blevet til rigtig mange, og måske har hun været særlig modtagelig for sygdom på dette tidspunkt. Tilfældet er dog ikke enestående. Vi kender til en historie fra Østrig hvor både far og søn blev alvorligt syge af B. cereus efter at have spist en dårlig opbevaret pastaret. Faren overlevede, men den voksne søn døde.

Giften

På Arbejdsmiljøinstituttet har vi kikket nærmere på arveanlæggene i de virulente varianter af B. cereus og har sammenlignet dem med andre nært beslægtede bakterier. Specielt ét giftstof er kommet i søgelyset, det såkaldte emetiske-toksin. B. cereus-varianter der kan lave dette giftstof kan forårsage en madforgiftning hvor symptomerne er kvalme og opkast, men kun sjældent diarré. Giftstoffet er meget modstandsdygtigt overfor almindelig tilberedning af mad. Er giftstoffet først dannet i fx pastaen, nedbrydes det altså ikke ved opvarmning.

Generne

Det genetiske grundlag (generne) for det emetiske-toksin sidder slet ikke i bakteriens kromosom, men på små selvstændige stykker DNA, de såkaldte plasmider. Plasmiderne kan opretholde sig selv i en bakteriecelle, uafhængigt af bakteriens kromosom. De deler sig før hver celledeling og sikrer selv, at efterkommerne får en kopi af plasmidet. Plasmiderne er meget små i sammenligning med bakteriens kromosom, og indeholder ofte kun nogle få promille af det DNA som er i kromosomet og som indeholder langt hovedparten af bakteriens arveanlæg.

Vi har fundet de plasmider, som indeholder generne for det emetiske-toksin i et samarbejde med Université Catholique de Louvain i Belgien. Vi har analyseret forskellige varianter af B. cereus som har givet sygdom; herunder isolatet fra den lille belgiske pige.

[På billederne i Figur 1 kan man se plasmid-profilerne fra en række B. cereus-isolater. Til højre på figuren kan man se hvilke plasmider der indeholder generne for det emetiske toksin. Det ses tydeligt at plasmiderne i banerne 3 til 7 indeholder det emetiske toksin. Vi fik yderligere bevis ved at isolere mutant-bakterier, som havde ”tabt” plasmidet. Disse havde også mistet evnen til at danne emetisk toksin.]

Beviset

Man behøver ikke at spise toksinet eller udsætte forsøgsdyr for det for at se om det har en effekt. Vi anvendte en metode, opfundet af en finsk forskningsgruppe, hvor man bruger orne-sæd. Hvis orne-sæd udsættes for en opløsning af det emetiske toksin ødelægges sædcellerns evne til at bevæge sig omgående. På den måde kunne vi udpeje de bakterier, der er i stand til at danne det emetiske toksin. Sammenholdt med genetiske fingeraftryk (Figur 1) var vi i stand til at lokalisere de gener som koder for det emetiske toksin i de virulente varianter af B. cereus. Det viste sig, at genet lå på et stort plasmid og kun var til stede i de virulente stammer. Dermed kommer den emetiske B. cereus i samme skuffe som miltbrandbakterien (B. anthracis) og biopesticidbakterien (B. thuringiensis) hvor toksin-generne også er lokaliseret på store plasmider.

2005_3 andrup_1.jpg
Figur 1. DNA profiler af forskellige isolater. Til venstre ses de forskellige plasmider som bakterierne indeholder. Plasmiderne i banerne 3 til 7 stammer fra emetiske . I banerne 6 og 7 er isolater fra det fatale uheld i Belgien. Til højre ses de plasmider, som indeholder generne for det emetiske toksin som mørke bånd mellem trekanterne.

De andre bakterier

Man har i flere end 10 år vidst, at B. cereus, B. anthracis og B. thuringiensis er nært beslægtede, trods deres vidt forskellige sygdomsfremkaldende egenskaber. B. anthracis er bakterien, der er ansvarlig for miltbrand (en dødelig infektion som er meget populær blandt terrorister), og B. thuringiensis anvendes som insektbekæmpelsesmiddel og udsprøjtes årligt i tonsvis fra flyvemaskiner og med håndpumper i kampen mod uønskede insektlarver. Det totale DNA fra forskellige repræsentanter fra alle tre bakterie-arter er nu blevet sekventeret og DNA ligheden mellem kromosomerne er faktisk så stor, at der rettelig burde være tale om den samme art. Men det praktiske og politiske i at en bakterie der bruges til biologisk bekæmpelse ikke er samme art som miltbrandbakterien, betyder at man indtil videre har valgt at opretholde separate arts-betegnelser. Plasmiderne har tilsyneladende den altafgørende rolle og bestemmer om det er insekter eller pattedyr der dør efter indtagelsen. For nyligt er der dukket hybrider op: et B. cereus  isolat der har givet miltbrand-lignende symptomer, et B. thuringiensis isolat der har givet nogle væmmelige sårinfektioner. I begge tilfælde har man fundet miltbrand-lignende gener spredt til B. cereus-lignende bakterier.

Plasmiderne spredes

I årene 1969-70 oplevede man en kraftig kolera-epidemi omkring Calcutta i Indien. Da man undersøgte patienterne nærmere fandt man, at sygdommen var for­årsaget af en almindelig Escherichia coli (E. coli) bakterie og ikke, som ventet, af den traditionelle kolera-bakterie Vibrio cholerae. Coli-bakterien var dog ikke helt sædvanlig - molekylærbiolo­giske undersøgelser viste, at bakterien indeholdte nogle gener fra V. cholerae, og at det var årsagen til, at den ellers fredelige E. coli nu var i stand til at forårsage kolera! Tilfælde er ikke enestående. Der findes talrige ek­sempler på, at bakterier ”opsnapper” arvemateria­le fra hinanden og udnytte det til egen fordel. Det er for eksempel meget udbredt i spredningen af antibiotika-resistens egenskaber.

Det fundamentale grundlag for evolutionen er den fortsatte foran­dring i arvemassen, arternes forskellig­hed og over­levelsen af de bedst egnede. Dette gælder både menne­sker og bakteri­er. Bakterier mangler dog en kønnet formering; dvs. de mangler forældrenes enestå­ende sam­men­blanding af arveanlæg til en ny unik skabning, som måske er bedre egnet til verden, som den ser ud her og nu. Som kompensation for kønnet formering, er der i den bakterielle verden opstået en anden slags genetisk omrøring. Den betegnes enten horisontal DNA-udveksling, gen-overførsel eller bakterie-sex, og foregår flittigt i naturen og kan studeres i labora­toriet.

DNA-udveksling i bakterier har været kendt siden 1950’erne, men først med den molekylærbiologiske revolution de seneste 20 år, har det været muligt at studere fænomenet nærmere. Der findes flere DNA-udvekslingssystemer, men det mest sociale består i at ”han”-bakterier indfanger en eller flere ”hun”-bakterier og, via sindrige molekylære enzymsystemer, overfører en del af deres arvemateriale til ”hun”-bakterien. Hun-bakterien bliver efterfølgende til en han-bakterie og er nu i stand til at videregive DNA til at andre bakterier

E. coli har være forskernes yndlingsbakterie i mange år, men den er ikke altid repræsenta­tiv for den mikrobielle verden.  På Arbejdsmiljøinstituttet har vi valgt biopesticidbakterien B. thuringiensis som model-bakterie, når vi studerer udveksling af DNA hos bakterier. Vi har opdaget et nyt DNA-udvekslingssystem, som er ekstremt effektivt. B. thuringiensis ”hanner” og ”hunner” klumper simpelthen sammen, hvis de tilfældig støder ind i hinanden (se elektronmikroskop-billedet). DNA-udvekslingssystemet er lokaliseret til store plasmider i B. thuringiensis, og det er i stand til at overføre sig selv og andre plasmider i cellen til andre bakterier – både B. thuringiensis og B. cereus… og sikkert også til isolater af B. anthracis, men dem har vi ikke haft lyst til at eksperimentere med.

Men betyder det ikke…? Jo, hvis en B. cereus, som får tilført et plasmid med insekttoksin-generne bliver den til en B. thuringiensis! Og sandsynligheden for, at en B. cereus som får tilført miltbrand-plasmiderne bliver dødelig sygdomsfremkaldende, er overvældende stor, men ingen har endnu udført forsøget (så vidt jeg ved). Uomtvisteligt er det, at forskellige medlemmer af B. cereus-gruppen har en fælles stamfader i en ikke så fjern fortid og at der kontinuerligt bliver rørt grundigt rundt i den genetiske suppe.

So what?

Forståelse af bakterien og virulensfaktorernes natur, udbredelse og dynamik har betydning for effektiv risikovurdering og forebyggelse. Resultaterne kan desuden danne basis for forbedret diagnostik og behandling. Der er en voksende erkendelse af, at bakteriers slægtskab er meget komplekst, artsgrænserne er flydende med ”missing links” en masse. Vi finder en lang række overgangsformer, hvor egenskaber fra miltbrand-bakterien dukker op i B. cereus og B. thuringiensis, og levnedsmiddel-toksiner identificeres i den insekttoksiske B. thuringiensis. Brug af de nye molekylærbiologiske teknikker åbner for en dybere forståelse af evolutionen, artsdannelsen og spredning af sygdomsfremkaldende egenskaber i det mikrobielle miljø – og det er ikke kun B. cereus der kan optræde både som Dr. Jekyll og Mr Hide.

Efterskrift

Arbejdsmiljøinstituttet var i maj måned vært ved en lille international workshop om denne gruppe af nært beslægtede bakterier. Vi diskuterede de seneste landvindinger, og organiserede fremtidigt samarbejde. Fra Danmark deltog forskere fra Arbejdsmiljøinstituttet, Danmarks Miljøundersøgelse, Dansk Fødevareforskning og Thomsen Bioscience. Sidstnævnte er en lille ny biotech virksomhed, som med deres banebrydende teknologi er langt fremme med udviklingen af små mobile detektions-enheder, der hurtig kan opspore miltbrand-bakterier. Danmark har markeret sig betydeligt internationalt med strategiske, tværfaglige samarbejder mellem arbejdsmiljø, ydre miljø, levnedsmiddelsikkerhed og molekylær grundvidenskab.

Læs mere:

Dierick, K., Van Coillie, E., Swiecicka, I., Meyfroidt, G., Devlieger, H., Meulemans, A., Hoedemaekers, G., Fourie, L., Heyndrickx, M. & Mahillon, J. (2005). A fatal family outbreak of Bacillus cereus food poisoning. J Clin Microbiol. In press.

Granum PE. & Lund T. (1997). Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol Lett. 157(2):223-8.

Hoton, FM., Andrup, L., Swiecicka, I., & Mahillon, J. (2005). The cereulide genetic determinants of emetic Bacillus cereus are plasmid-borne. Microbiol. 151: 2121-2124.

Mahler, H., Pasi, A., Kramer, J. M., Schulte, P., Scoging, A. C., Bär, W. & Krähenbühl, S. (1997). Fulminant liver failure in association with the emetic toxin of Bacillus cereus. N Engl J Med 336, 1142-1148

Figur 1. DNA profiler af forskellige isolater. Til venstre ses de forskellige plasmider som bakterierne indeholder. Plasmiderne i banerne 3 til 7 stammer fra emetiske . I banerne 6 og 7 er isolater fra det fatale uheld i Belgien. Til højre ses de plasmider, som indeholder generne for det emetiske toksin som mørke bånd mellem trekanterne.