Jens Christian Skou

Publiceret April 2000

I oktober 1997 overrakte Kong Carl XVI Gustaf for Det Kongelige Svenske Videnskabernes Akademi, Nobel Prisen i Kemi for 1997 med en halvdel til Jens C. Skou for den første opdagelse af et jon transporterende enzym, Na,K-ATPase (1-2). Den anden halvdel delte Paul D. Boyer, University of California, Los Angeles og John E. Walker, Cambridge, England for deres opklaring af den enzymatiske mekanisme bag syntesen af ATP.

Skou's opdagelse af Na,K-ATPase

Skou tog medicinsk eksamen i København i 1944 og havde som ung læge planer om at blive kirurg. Han var ansat på Hjørring sygehus 1944-46, men fik i 1947 en stilling som amanuensis på Fysiologisk Institut ved Aarhus Universitet hvor han begyndte at arbejde med en problemstilling han havde medbragt fra kirurgisk afdeling, mekanismen bag virkningen af lokalanæstetika. Det blev til en monografi "Lokalanæstetika", som Skou forsvarede for den medicinske doktorgrad i 1954, og en serie artikler i farmakologiske og fysiologiske tidsskrifter.

ATPase aktivitet
Figur 1. ATPase aktivitet som funktion af koncentrationen a K+ i tilstedeværelse af 6 mM Mg2+ og forskellige koncentrationer af Na+. Enzymreaktionen igangsættes ved tilsætning af 100 :l suspension af nercvemembraner fra krabber til 0.9 ml medium med 3 mM ATP, 6 mM MgCl2, KCl og NaCl som angivet og 30 mM histidin, pH 7,2. Efter 15 min ved 36oC stoppes reaktionen med 0,1 ml 50% trikloreddikesyer. Prøven centrifugeres, og uorganisk fosfat måles i spektrofotometer efter reduktion af komplekset med molybdat. Gengivelse af Figur 5 i reference 1.

I 1953 studerede Skou effekten af lokalanæstetika på overfladetrykket i monomolekylære lag af nervelipider, der var spredt ud på vandflader i Langmuir trug. Han fandt at lokalanæstetika i lipidfasen øgede overfladetrykket og at stigningen i tryk var korreleret til stoffernes anæstetiske virkning. Han rejste spørgsmålet, om denne stigning i overfladetryk har indflydelse på strukturen af Na+ kanaler i nervemembranen og således kan forklare den anæstetiske effekt. For at stabilisere enzymaktiviteter i lipidfasen søgte Skou efter lipoproteiner med enzym aktivitet. Under et ophold i 1954 på den marinbiologiske forskningsstation i Woods Hole nær Boston blev Skou opmærksom på beskrivelser af en Mg-ATPase i membraner fra kæmpe axoner fra blæksprutter. Skou havde ikke adgang til blæksprutter, men tilbage i Aarhus fandt han en Mg-ATPase i membran fraktioner fra krabbe nerver. ATPase aktiviteten varierede fra præparat til præparat uden en rimelig forklaring. Han fjernede Na+ og K+ holdige buffere fra medierne og fandt efter flere måneders forsøg med systematisk søgning at Na+ øgede ATPase akviteten når han brugte K+ salt af ATP, men ikke når han brugte Na+-ATP, d.v.s. at aktiviteten var afhængig af Na+ plus K+. Skou kunne gennemføre en detaljeret analyse af Na,K-ATPase aktiviteten i nervemembraner. Den blev publiceret i 1957 i Biochimica et Biophysica Acta (1). Som eksempel på resultaterne viser Figur 1 den oprindelige Fig. 5 af de ialt 11 figurer i artiklen. Det ses at der er tale om meget nøjagtige målinger. Den vandrette kurve viser at der ikke er ATPase aktivitet med K+ alene i mediet. I tilstedeværelse af Na+ i mediet stiger ATPase aktiviteten når K+ tilsættes indtil den når et maksimum, der afhænger af koncentrationen af Na+, og højere koncentrationer af K+ hæmmer aktiviteten. Fordi krabben lever ved høje saltkoncentrationer er de optimale koncentrationer højere end hos pattedyr. Senere fandt Skou at ouabain (digitalis) hæmmer aktiviteten af Na,K-ATPase i nervemembraner. Valget af krabbe nerverne var meget heldigt, idet senere eksperimenter har vist, at det er et af de få væv hvor Na,K-ATPase aktiviteten er eksponeret uden brug af detergenter. Dog var det et problem, at Skou måtte præparere ca. 25.000 nerver for at få væv nok. For at slå krabberne ihjel blev de kogt i vand og lugten bredte sig over hele institutet.

Jens C. Skou modtager sin Nobel pris
Jens C. Skou modtager sin Nobel pris af Hans Majestæt
Kong Carl XVI Gustaf i Stockholms Konserthus den
10. december 1997.

Skou fortsatte med analyser af Na,K-ATPase aktiviteterne i hjerne og nyre. I andre laboratorier blev det vist at Na,K-ATPase findes i alle væv og celler, hvor der kan påvises aktiv Na,K-transport over cellemembranen, og at aktiviteten af enzymet er proportional med kapaciteten for aktiv Na,K-transport. Udfra disse og andre forsøg kunne Skou vise at systemet opfylder en række kriterier, som må opfyldes for at etablere en forbindelse mellem den enzymatiske aktivitet og aktiv transport af Na+ K+ over cellemembranen (2).

Perspektiverne i Skou's opdagelse

Skou?s biokemiske definition af Na,K-ATPase etablerede en direkte kobling af ATP spaltning til Na,K-transport over membranen. Na,K-pumpen var således identificeret som et enzym og et protein. Herved havde han skabt grundlaget for en række nye undersøgelser af pumpens struktur og mekanisme. Studiet af de enzymatiske aspekter af den aktive transport betød også et fagligt skift, fra traditionelle fysiologiske undersøgelser på celler og væv til biokemiske analyser på isolerede membraner og proteiner. Ved definitionen af Na,K-ATPase havde Skou etableret det nødvendige værktøj for renfremstilling og karakteristik af pumpens protein. Den vigtigste betingelse for oprensning er et godt assay, der giver et mål for mængden af det specifikke protein i et givet præparat. Her var måling af Na,K-ATPase aktiviteten eller binding af ouabain ideelle, men selv om betingelserne var til stede, var det først mere end 10 år senere, i 1969-1973, at forsøgene på renfremstilling af Na,K-ATPase begyndte at lykkes (3).

Et eksperimentelt bevis for at Na,K-ATPase er identisk med Na,K-pumpen i cellemembranen kom i 1971, da S. Goldin og L. Hokin kunne indbygge Na,K-ATPase i fosfolipid vesikler og demonstrere aktiv Na+ og K+ transport over vesiklernes membran ved tilsætning af ATP. Før Skou?s opdagelse var Na-pumpen karakteriseret i frøskind ved Ussing's målinger på frøskind og ved flux målinger med isotoper i intakte celler, især i nerver og røde blodlegemer. Så tidligt som 1902 gjorde Overton opmærksom på at hjertes og musklernes kontraktioner må medføre at noget Na+ må transporteres ind i cellen og noget K+ ud af cellen for hver kontraktion og at der må være en mekanisme som modvirker denne udligning. Ørskov viste i 1934 at røde blodlegemer fra duer taber K+ når de udsættes for bly og at de optager K+ ved aktiv transport når blyet fjernes. Ørskov fandt også at optagelsen af K+ i røde blodlegemer fra fugle kan stimuleres af noradrenalin. Ud fra studier af muskelcellers optagelse af Na+ og tab af K+ under arbejde definerede Dean i 1941 som den første Na,K-pumpen ved dens transport af Na+ ud og K+ ind over cellemembranen. August Krogh studerede allerede i 1938 aktiv transport af NaCl hos vanddyr og fandt at frøer kunne optage Na+ gennem huden fra ekstremt fortyndede opløsninger. Hans H. Ussing udviklede konceptet for aktiv transport med operationel definition af den aktive transport af Na+ ved flux-tratio for ioner og elektriske målinger af kortslutningsstrømmen over frøkind. Digitalisglykosidernes hæmning af pumpen blev beskrevet i 1953 af Schatzmann, der fandt at den koblede transport af Na+ og K+ i røde blodlegemer blokeres af strofantin. Glynn i Cambridge og Post på Vanderbilt University i USA studerede Na,K-transport i røde blodlegemer og Post fandt i 1956 at transport forholdet var tre Na+ ud og to K+ ind. Det var også kendt fra studier på frøskind og nerver at den aktive Na,K-transport var koblet til cellernes produktion af energi, idet den kunne hæmmes af cyanid og andre metaboliske gifte.

Modtagelsen af Skou's første artikel 1957 var meget behersket. Post og Glynn begyndte straks at arbejde med sammenhængen mellem ATP spaltning og Na,K-transport i røde blodlegemer. Senere arbejdede Post med de intermediære trin i processen, især fosforylering fra ATP og defosforylering. Derudover var der ringe interesse for den nye ATPase aktivitet. Faktisk var der omkring 1960 større interesse i USA for Hokin's teori om fosfatidsyre cyklus som forklaring på Na-pumpen i saltkirtler. Det var først i 1962-63 at antallet af publikationer om Na,K-ATPase og Ca-ATPase begyndte at stige væsentligt.

Na,K-pumpens fysiologiske betydning

Da Na,K-pumpen transporterer flere Na+ joner ud end K+ joner ind i cellen er den elektrogen, d.v.s. at den skaber et elektrisk potential over membranen med positiv yderside. Potentialet er en betingelse for at nerveimpulser kan løbe langs nerver og muskelceller. Pumpen fungerer således som et batteri, der er forudsætning for dannelse af impulser i centralnervesystemet. Det er grunden til at hjernen er så følsom for iltmangel, idet ATP dannelsen ophører og pumpen standser. Det potentiale Na,K-pumpen skaber er også en forudsætning for opretholdelse af det normale cellevolumen i alle organismens celler. Hvis pumpen standser på grund af mangel på ilt og ATP svulmer cellerne. De Na+ gradienter over membranen, som pumpen vedligeholder, bruges til sekundært aktiv transport, f. eks. af glukose og aminosyrer i tarm og nyrer. Na+ gradienterne kan også bruges til transport af andre joner over cellemembranen. Na+ kan således udveksles med protoner, H+, ved Na/H-exchange, et system der er vigtigt for regulation af pH i cellernes cytoplasma. Na+ joner kan også udveksles med Ca2+ joner, som forlader cellen. Denne mekanisme er en grund til at digitalis kan styrke hjertets aktivitet, idet hæmning af Na,K-pumperne betyder at aktiviteten af Ca2+ i cellen øges. I hvile bruger Na,K-ATPase 15-20% af den producerede ATP mængde, ca 70 kg per dag, til Na,K-transport i nyrer, centralnervesystem og organismens øvrige celler, hvor Na,K-gradienter er forudsætning for opretholdelse af membranpotentiale og cellevolumen.

Jens C. Skou i laboratoriet
Jens C. Skou i laboratoriet under forsøg med den renfremstillede Na,K-ATPase

En række vigtige stoffer har sideeffekter på Na,K-pumpen. Insulin og noradrenalin øger K+ optagelsen i muskler og dopamin hæmmmer Na,K-pumpen i nyren. Den farmakologiske interesse i Na,K-pumpen er begrænset, måske fordi pumpen er livsvigtig for alle organismens celler, og ændringer af dens aktivitet kan have farlige bivirkninger. I modsætning hertil er H,K-pumpen i mavesækken ikke livsnødvendig, men forudsætning for at nyde livet med et godt måltid og stoffer, der hæmmer syresekretionen (ranitidin, cimetidin) eller blokerer H,K-pumpen totalt (omeprazol, losec), hører til blandt de mest solgte farmaka.

Jens Chr. Skou som forsker og underviser på universitetet

For at forstå rækkevidden af Skou's basale opdagelser og hans usædvanlige bidrag til fysiologi og kemi, er det vigtig at omtale Skou?s arbejde som forsker og underviser. I slutningen af 50erne var Aarhus Universitet i en opbygningsfase med 1500-2000 studenter. Skou var lektor i medicinsk fysiologi på et institut med to amanuenser og en professor der reelt var pensioneret. Skou holdt de ugentlige forelæsninger i fysiologi over hele Lundsgaards lærebog over to semestre og han examinerede næsten alle studerende i fysiologi ved første del. Det var fremragende undervisning med vægt på de vigtige principper for fysiologiske funktioner. Skou var ekspert i væske-elektrolyt balance og arbejdede sammen med den kirurgiske afdeling på Aarhus Kommunehospital ved etablering af hæmodialyse ved akut anuri og intensiv behandling.

Hvordan var hans holdninger og hvordan arbejdede han på institutet? Et vigtig vinkel til besvarelse af de spørgsmål er at kende hans holdning til eksperimenter i laboratoriet. For Skou betod arbejdet på institutet i at tage en kittel på og eksperimentere i laboratoriet indtil han blev afbrudt. Det var hans basale tilstand, men den var ikke en særlig afslappet, idet han arbejdede med ubrudt energi og betydelig fysisk udfoldelse. Andre aktiviteter i kontoret, møder, studenter og gæster var forpligtelser, der afbrød det vigtige, arbejdet med reagensglas, centrifuger, membranpræparater og måleinstrumenter.

Den ene del af hans laboratorium var organiseret og systematisk, her arbejdede laborant Inge Raungaard med ATPase assay til katjonkurver og systematiske målinger af fosforylering og defosforylering for at opklare Na,K-ATPase reaktionens mekanisme. Den anden del af laboratoriet var Skous egen, hvor han arbejdede med rastløs energi og mindre organisation efter en ny opdagelse. For at finde Skou på institutet behøvede man bare at følge sporene, en række af brugte reagensglas, centrifugerotorer og stativer med Carlsberg mikropipetter, et bundt for hver opløsning. Her fandt man Skou arbejdende med alle de uafklarede aspekter af Na,K-ATPase i membranen. Var myosin, aktin, RNA eller lipider nødvendige dele af systemet? Hvilke stoffer stimulerer eller hæmmer pumpens aktivitet? Han undersøgte et utal af præparative procedurer for at oprense Na,K-pumpen, med detergenter og utallige centrifugeringer og forsøg på at solulilisere og fraktionere proteinet. Omkring 1960, da jeg arbejdede i laboratoriet som student var det som i en guldmine hvor nogen lige havde gjort et fund og Skou arbejdede for at gøre flere opdagelser. På det tidspunkt var kun få membranproteiner beskrevet og de lå som sovende skønheder og ventede på at blive opdaget.

Skou havde en usædvanlig stor kapacitet for at være intenst optaget af eksperimentet som sådan. Det biokemiske eller fysiologiske forsøg var hans værktøj for at afgøre spillet melem hypothese og fakta. Det var resultatet af eksperimentet, der talte og Skou ville helst gøre forsøgene med sine egne hænder. Typisk, når en ny artikel kom op med en tilsyneladende vigtig konklusion om Na,K-pumpen fra en ny metode, ville Skou sige til sig selv, -og sommetider højt, "jeg tror ikke på det her". Han ville starte arbejdet ved bænken og kontrollere det, forstå eksperimentet ved at se dets resultater, argumentere med det og endelig træffe afgørelse om dets værdi. Det var i en periode hvor mange biokemiske metoder var usikre og mange artikler fra den tid havde en overlevelsestid som sommerfugle.

Der var tale om store krav til kvalitet og signifikans af laboratoriedata. Skou viste ingen nåde overfor rutine-biokemikere, der kom som gæster for at skrive et par lette artikler med en celebritet. Han var så tilbageholdende at han ikke skrev nogen artikler om Na,K-ATPase med andre forskere som medforfattere i perioden fra 1957 til 1969. Mange prøvede, både danskere og udenlandske gæster, men Skou's krav til signifikante resultater blev en legende. "Er Du sikker? Har du kontrolleret dette og hint?" og endelig "nej, jeg tror virkelig ikke der er noget nyt at publicere her". Hans meninger om Na,K-pumpens mekanisme var ikke lette at ændre og han var ofte i opposition til andre forskere indenfor feltet. Et kendt eksempel er Post's model for Na+ afhængig fosforylering og K+ aktiveret defosforylering ved energioverførsel i pumpen. Skou arbejdede i 60erne og 70erne med alternative modeller hvor den transiente fosforylering ikke var en del af reaktionen. Han foreslog hybrid binding af Na+ og K+ i proteinet med simultan udskiftning af jonerne ved binding og hydrolyse af ATP. Dette var i modsætning til Post's model hvor transporten sker i en ping-pong reaktion hvor pumpen først transporterer Na+ ud og derefter udveksler Na+ med K+ på ydersiden. I samarbejde med grupper i USA tog Skou initiativ til til de Internationale Conferencer om Na,K-pumpen og andre cationpumper. Conferencerne er på skift afholdt i USA og Europa, og diskussionerne omkring ATP binding, fosforylering - defosforylering og overførsel af den kemiske energi til transport var centrale emner på disse møder. Det sidste møde blev afholdt i Japan i 1999 og den "10th Conference on Na,K-ATPase and related cation pumps" afholdes i København i år 2002.

Referencer:

  1. Skou JC. The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from peripheral nerves. Biochim. Biophys. Acta 1957; 23: 394-401
  2. Skou JC. Enzymatic basis for active transport of Na+ and K+ across cell membrane. Physiol. Rev. 1965; 45: 596-617
  3. Jørgensen PL. Isolation and characterization of the components of the sodium pump. Quart. Rev. Biophys. 1975; 7: 239-74.