Immunmodulerende effekter af plastblødgøringsmidler. Struktur-aktivitets relationer

Søren Thor Larsen, Jitka Stilund Hansen og Gunnar Damgård Nielsen, Arbejdsmiljøinstituttet, Lersø Parkallé 105, 2100 København Ø. stl@arbejdsmiljoforskning.dk 

Luftvejsallergi er blevet en folkesygdom

Siden 1960’erne har vi oplevet en nærmest epidemisk udvikling i luftvejsallergier og resultatet er, at i dag lider ca. 300.000 danskere af astma mens op imod en million har høfeber. Derfor er det heller ikke overraskende, at den danske regering har udpeget overfølsomhedssygdomme, herunder luftvejsallergi, som en af Danmarks otte store folkesygdomme. Da stigningen i forekomsten af luftvejsallergi er foregået meget hurtigt, må miljøfaktorer nødvendigvis spille en dominerende rolle. Hvilke miljøfaktorer, der har betydning vides ikke, men undersøgelser tyder på, at faktorer som kost og udsættelse for luftforureninger er risikofaktorer. En af de bedst undersøgte luftforureninger med allergifremmende effekt er dieseludstødningspartikler, men også andre stoffer kan spille en rolle. Således tyder en række epidemiologiske undersøgelser på, at der findes en sammenhæng mellem udsættelse for phthalater og symptomer på astma eller høfeber, og laboratorieforsøg har vist, at visse phthalater ændrer immunsystemets reaktion overfor allergener. Det er således påvist i forsøgsdyr at visse phthalater kan øge mængden af antistoffer rettet mod samtidigt indgivet antigen, dvs. phthalatet har adjuvanseffekt.

Stor forskel på de enkelte phthalaters adjuvanseffekt

Der er en markant forskel mellem de forskellige phthalaters evne til at fungere som adjuvanser. Selv en lille ændring af phthalatets molekylstruktur eller dets fysisk/kemiske egenskaber, har markant effekt på phthalatets adjuvanseffekt. Mekanismen bag phthalaternes adjuvanseffekt er ikke kendt, og det står derfor ikke klart, om phthalaternes adjuvanseffekt er medieret via en specifik receptor eller om adjuvanseffekten skyldes en mere uspecifik mekanisme. Derfor iværksatte vi nærværende projekt som havde til formål at identificere hvilke strukturkemiske og/eller fysisk-kemiske egenskaber, der betinger adjuvanseffekt hos phthalater og beslægtede stoffer.

Strategi for undersøgelsen

Vores undersøgelse tog udgangspunkt i phthalatet di-(2-ethylhexyl) phthalat (DEHP), som tegner sig for omtrent halvdelen af verdensforbruget af phthalater på ca. 3,5 millioner tons årligt. DEHP er interessant af flere årsager. Dels sættes stoffet i forbindelse med astma i det hidtil bedst udførte epidemiologiske studie på området (Bornehag et al., 2004) og dels er DEHP det phthalat, der havde den kraftigste adjuvanseffekt i dyreeksperimentelle studier (Larsen et al., 2002). Endvidere kan DEHP øge frigivelsen af stoffet histamin fra basofile granulocytter isoleret fra allergiske personer (Glue et al., 2005). Histaminfrigørelse er årsag til en del af de symptomer som opleves i forbindelse med en allergisk reaktion. Strategien i nærværende projekt var, med DEHP som referencestof, systematisk at ændre strukturkemiske og fysisk-kemiske forhold, for at kunne vurdere hvilke faktorer, der betinger adjuvanseffekten. Hvis effekten af DEHP skyldes en mere eller mindre uspecifik fysisk-kemisk interaktion med cellemembraner, må det forventes at andre stoffer med samme lipofilitet har en lignende adjuvanseffekt. Skyldes adjuvanseffekten af DEHP derimod binding til en specifik receptor, må det forventes, at den tredimensionelle struktur af DEHP molekylet har afgørende betydning.

De udvalgte teststoffer blev undersøgt for adjuvanseffekt i en etableret dyremodel, hvor mus injiceres med teststof tilsat et modelallergen, albumin fra hønseæg (ovalbumin, OVA). Administrationsvejen er af mindre betydning for påvisning af adjuvanseffekt. Musenes immunsystem reagerer ved at danne antistoffer specifikt rettet mod det artsfremmede protein OVA. Gives OVA sammen med en adjuvans dannes større mængder antistof end hvis OVA gives alene. Adjuvanseffekten af teststoffet kan vurderes kvalitativt og kvantitativt ud fra produktionen af de OVA-specifikke antistoffer IgE, IgG1 og IgG2a.

Allergisk astma og allergisk høfeber er IgE-medierede allergier, dvs. kroppen har dannet IgE-antistoffer, som specifikt reagerer mod det allergen, der giver anledning til et anfald af høfeber eller astma. Den type af immunrespons som giver anledning til IgE-medieret allergi, giver hos mus normalt også anledning til dannelse af IgG1-antistoffer. Da phthalater erfaringsmæssigt giver anledning til en begrænset stigning i IgE-produktionen, blev adjuvanseffekten af phthalaterne i nærværende studie primært vurderet på baggrund af IgG1-produktionen.

Resultater

Adjuvanseffekten af teststofferne blev kvantificeret som det antal gange blandingen teststof/OVA øgede blodets indhold af antistoffer i forhold til behandling med OVA alene, i dette studie anført som ”adjuvansfaktor”. Eksempelvis havde vores referencestof, DEHP, en adjuvansfaktor på 61, idet mus som blev injiceret tre gange med 100 g DEHP i blanding med OVA, viste serumniveauer af IgG1 som er 61 gange højere end kontrolmusene, som blev injiceret tre gange med OVA (Figur 1).  

Lipofilitet

For at vurdere hvilken effekt lipofiliteten har for adjuvanseffekten af phthalater, undersøgte vi phthalater med forskellig længde af de to alkylkæder (jf. faktaboks). Jo længere kæder, jo mere lipofilt er phthalatet. Vi har vist, at phthalater med to alkylkæder med hver 8 kulstofatomer havde maksimal adjuvanseffekt (Larsen et al., 2002). Vi syntetiserede butyldodecylphthalat (BDP, stof II), som havde en ”skæv” fordeling af kulstofatomer (jf. Figur 1), så i stedet for 8+8 kulstofatomer havde stoffet 4+12 kulstofatomer i alkylkæderne. Men DBP er stadig et phthalat med en sum af kulstofatomer i alkylkæderne på 16, og dermed samme lipofilitet som DEHP. BDP viste sig at have omtrent samme adjuvansfaktor som DEHP, og vi kunne konkludere at phthalaternes to alkylkæder ikke behøver at være lige lange for at stoffet har adjuvanseffekt, så længe lipofiliteten er den samme som for DEHP.

Det næste spørgsmål, der meldt sig var: har stoffer uden phthalaters struktur adjuvanseffekt, hvis deres lipofilitet er den samme som DEHPs? Det har været foreslået i litteraturen (Seong og Matzinger, 2004) at adjuvanseffekt kan skyldes lipofilitet i sig selv. Derfor undersøgte vi stoffet methylpalmitat (MP, stof III), som har samme lipofilitet som DEHP. DEHP har to estergrupper, mens MP kun har én, og MP indeholder, i modsætning til phthalater, ikke en benzenkerne. MP havde ingen adjuvanseffekt, så vi kunne konkludere at lipofilitet ikke i sig selv er ensbetydende med adjuvanseffekt. Resultatet er i overensstemmelse med et andet studie som viste, at MP er inaktivt som adjuvans i mus ved indånding (Hansen et al, 2007).

Struktur

DEHP har to orthostillede estergrupper (jf. Fig 1). Stoffet di-(2-ethylhexyl) terephthalat (DOTP, stof IV) svarer til DEHP, bortset fra at den ene estergruppe er flyttet således at de to estergrupper er parastillede (jf. Fig. 1). DEHP og DOTP indeholder således de samme funktionelle grupper, og har samme lipofilitet. Vores undersøgelse viste, at når den ene kæde flyttes fra orthostilligen til parastillingen, reduceres adjuvansfaktoren fra 61 til 4, dvs. en reduktion på 90-95%. DOTP bekræfter således at en bestemt lipofilitet ikke i sig selv giver adjuvanseffekt, og heller ikke antallet af estergrupper ser ud til at være en determinant for adjuvanseffekten.

Er det så strukturen med de orthostillede estergrupper som giver effekten? For at undersøge dette, valgte vi stoffet trioctyl trimellitat (TOTM, stof V). TOTM har to orthostillede estergrupper præcis som DEHP, men TOTM har desuden en tredje estergruppe, som gør molekylet mere lipofilt end DEHP. Undersøgelse af TOTM, viste at det var komplet inaktivt mht. adjuvanseffekt. Strukturen med to nabostillede estergrupper med tilsammen 16 kulstofatomer medfører altså ikke i sig selv adjuvanseffekt, ligesom lipofilitet heller ikke i sig selv giver anledning til adjuvanseffekt – det er kombinationen af de to forhold, som giver effekten

Kan det bruges til noget?

På baggrund af projektet kan vi konkludere, at hvis et phthalat skal fungere som adjuvans, er der både strukturkemiske og fysisk-kemiske betingelser som skal være opfyldt. Med phthalater som modelstofgruppe, har vores studie vist, at adjuvanseffekt, som er en uønsket effekt af industrikemikalier, kan reduceres eller helt elimineres ved enten at ændre stoffets lipofilitet eller ved at ændre strukturkemien. Disse ændringer af molekylet vil i visse tilfælde kunne foretages uden at stoffet mister sine ønskede tekniske egenskaber der gør, at stoffet eksempelvis kan anvendes som PVC-blødgører. Vi arbejder i øjeblikket sammen med Danmarks Farmaceutiske Universitet om at udvikle en computermodel til prædiktion af phthalaters adjuvanseffekt. Med phthalater som modelstofgruppe, håber vi således på at kunne bidrage med viden om hvordan adjuvanseffekt kan undgås i forbindelse med udviklingen af nye kemiske stoffer.

Referencer

Bornehag CG, Sundell J, Weschler CJ, Sigsgaard T, Lundgren B, Hasselgren M, Hagerhed-Engman L. The association between asthma and allergic symptoms in children and phthalates in house dust: a nested case-control study. Environ Health Perspect 2004; 112, 1393-1397.

Glue C, Platzer MH, Larsen ST, Nielsen GD, Skov PS, Poulsen LK. Phthalates potentiate the response of allergic effector cells. Basic Clin Pharmacol Toxicol., 2005; 96, 140-142 

Hansen JS, Larsen ST, Poulsen LK, Nielsen GD. Does lipophilicity per se induce adjuvant effects? Methyl palmitate as model substance does not affect ovalbumin sensitization. J Toxicol Environ Health, Part A, 2007, in press.

Larsen ST, Lund RM, Nielsen GD, Thygesen P, Poulsen OM. Adjuvant effect of di-n-butyl-, di-n-octyl-, di-iso-nonyl and di-iso-decyl phthalate in a subcutaneous injection model using BALB/c mice. Pharmacol Toxicol, 2002; 91, 264-272.

Seong SY, Matzinger P. Hydrophobicity: an ancient damage-associated molecular pattern that initiates innate immune responses. Nat. Rev. Immunol, 2004; 4, 469-478.

Acknowledgement/Taksigelse

Projektet er udført med støtte fra Indenrigs- og Sundhedsministeriets Miljømedicinske Forskningscenter (http://www.ismf.dk/)

Phthalater Phthalater er en fællebetegnelse for en gruppe af kemiske stoffer, som alle er kemiske derivater af phthalsyre. På figuren nedenfor symboliserer R1 og R2 de to alkylsidekæder, som kan variere i bl.a. længde. Forskellige phthalater har forskellige anvendelsesområder; phthalater bruges bl.a. til blødgøring af PVC, rustbeskyttelsesbehandling af fabriksnye biler og som hjælpestof i maling, lak og fugemasser. Phthalater, som bl.a. stammer fra byggematerialer, adsorberes til støv. Jo længere tid støvet får lov at ligge på den phthalatholdige overfladen, des højere bliver phthalatkoncentrationen i støvet. Når støvet hvirvles op og indåndes, udsættes man dels for phthalat, men også for de allergener, som er en almindelig bestanddel af støv fra fx boliger og kontorer. Rengøring fjerner støv, allergener og adjuvanser, og er derfor en væsentlig forebyggelseskilde.