Molekylære markører
er vigtige redskaber i optimering af produktionsformer og produktkvalitet i
landbruget. I produktion af husdyr er det især biomarkører for
sundhedsegenskaber og produktkvalitet, der har stor værdi. Proteomteknologi er
i dag meget anvendt i jagten på molekylære markører, og ved Danmarks
JordbrugsForskning har store teknologiske investeringer og en lang række
projekter i de seneste år sat skub i jagten på molekylære markører også i
husdyr. Denne artikel giver et indblik i
nogle teknologier og igangværende projekter på området.
Behovet for molekylære markører i husdyrproduktionen
Set med internationale øjne er dansk landbrug meget langt fremme i
anvendelsen af moderne produktionsformer. Dette indebærer, at husdyrenes
produktionsegenskaber (fx mælkeydelse, tilvækst, foderudnyttelse) igennem de
seneste årtier stadigt er blevet optimeret, men også at stadigt mere intensive
produktionsformer og større dyreenheder er almindelige. Samtidig skaber
ændringer i produktionsformerne nye udfordringer, hvor løsningerne kræver
udvikling af ny biologisk viden. Jagten på biomarkører for vigtige produktions-
og sundhedsegenskaber hos husdyr er et forskningsområde, der har stort
potentiale for at løfte nogle af de udfordringer, en industrialiseret
husdyrproduktion står overfor.
Information om husdyrenes genomsekvens, der for kvægs vedkommende
allerede er tilgængelig, og for svin forventes afsluttet i 2007, er også
medvirkende til, at jagten på biomarkører i svin og kvæg nu kan gennemføres på
lige fod med tilsvarende projekter i mennesket og i klassiske modelorganismer
som mus, rotter og gær. Derfor er der også i husdyrforskningen sat fokus på at
beskrive genernes funktion ved hjælp af integration af post-genome teknologier,
hvilket omfatter proteomics, transkriptomics, og metabolomics, ofte omtalt som
”omics” teknologier.
En række igangværende projekter har til formål at beskrive proteinbaserede
biomarkører for sundheds- og produktionsegenskaber, genetisk variation og tidlig diagnostik
af sygdomme i svin og kvæg. Denne artikel beskriver aktuelle eksempler på
anvendelsen af proteomteknologi i jagten på biomarkører i svin og kvæg.
Teknologiplatforme til husdyr-proteomics
Proteomanalyse har som mål at beskrive ændringer og mønstre i cellers
proteinekspression, ofte med henblik på at finde proteinbaserede biomarkører,
der beskriver et sygdomsforløb eller kan bruges til diagnostik. De
proteomteknologier og tilgangsvinkler, der bruges i jagten på biomarkører i
husdyr, svarer i store træk til teknologier, der er velkendte fra anden
biomedicinsk forskning, og er i dag baseret på automatiseret
proteinkarakterisering igennem et samspil af elektroforeseteknologi, HPLC og
massespektrometri (MS).
På et vigtigt punkt adskiller husdyr-proteomics sig væsentligt fra
human-medicinsk proteomics, nemlig i tilgangen til vævsmateriale. Hvor det i
medicinsk forskning tit er tilgangen til informative prøver, der begrænser
projektets målestok, er dette sjældent tilfældet i husdyrforskningen. For eksempel kan vi gennemføre et meget stort
screeningsprojekt for tidlige diagnostiske markører for yverbetændelse hos kvæg
ved at inddrage mælkeprøver, der er indsamlet fra flere tusinde dyr, og hvor
indgående kendskab til dyrenes genetik, fodring, og sygdomsforløb ligger til
grund for markøranalyserne. Desuden er det muligt at indsamle mælke- og
vævsprøver på optimal og ensartet vis. Dette gør det muligt at anvende
storskala teknologier, hvor kvantificeringsprincipperne er baseret på, at
observationerne er udført i et meget stort dyremateriale, og at den tekniske
variation er meget lille.
Ved Danmarks JordbrugsForskning analyserer vi komplekse proteomprofiler
hovedsageligt igennem samspillet af to meget forskellige
massespektrometri-platforme, der er beskrevet i Figur 1.
 |
Figur 1. Teknologiplatforme i proteomanalyse: Et samspil af to meget
forskellige teknologi platforme bruges i biomarkør analysen. Til storskala
screening bruges robot-baseret prøve forberedelse og MALDI-TOF baseret protein/peptid
fingerprint analyse. I en stor-skala analyse kan man nemt gennemføre 1000
analyser per uge. I projekter hvor sekvensinformation og kvantitativ
sammenligning er af væsentlig interesse bruges HPLC-baseret protein og peptid
separation efterfulgt af ESI-MS/MS analyse. I en høj resolution screening kan
vi i løbet af en uge typisk analysere fire vævsprøver, og fra disse
identificere og sammenligne 1000 proteiners ekspressionsprofil. |
MALDI-TOF-baseret storskala platform bruges
hovedsageligt til at beskrive peptidmønstre (peptidfingerprinting). Denne
teknologi er meget hurtig, og da prøveforberedelsen også i vid udstrækning er
robot-baseret, er det muligt at analysere peptidmønstre fra ca. 1000 dyr i
løbet af en uge. Biomarkøranalyse ved hjælp af MALDI-TOF er derfor baseret på
analyser af meget store populationer af dyr, men er ikke optimal til
identifikation og kvantificering af de enkelte proteiner i komplekse prøver,
som væv og celler fra dyr typisk er. Arbejdsgangen i et MALDI-TOF-baseret
storskala projekt er beskrevet i Figur 2.
 |
Figur 2. Arbejdsgangen i en stor-skala proteom screening for tidlige
markører for yver betændelse: Mælkeprøver indsamles fra meget store
populationer af dyr (ca.100 dyr dagligt). Prøverne kommer fra både raske dyr,
og fra dyr med varierende stadier af betændelse i yveret. Prøverne
klassificeres i henhold til klinisk-kemisk diagnostik. Ved hjælp af
robot-baseret fraktionering og prøveforberedelse kan et meget stort antal
prøver undersøges (ca 1000 prøver hver uge) og en automatisering af MALDI-TOF
instrumentet gør det muligt at analysere tusinder af fingerprint-spektre der
danner grundlaget for en robust statistisk analyse af ændrede peptid-mønstre
hos henholdsvis syge og raske dyr. |
LC-LC-MS/MS-baseret højresolutions platform bruges derimod
hovedsageligt til at beskrive og kvantificere de enkelte proteiner i komplekse
vævsprøver. Prøveforberedelsen fra væv og celler er baseret på gentagne
HPLC-separationer (LC-LC) af vævets proteiner, efterfulgt af serier med
automatiseret tandem massespektrometri (MS/MS). I løbet af en uge er det muligt at sammenligne væv fra ca. fire dyr og
dermed beskrive ændrede ekspressionsmønstre og sekvensvariation i ca. 1000
proteiner fra vævsprøverne. Derfor bruges denne teknologiplatform oftest i
projekter, hvor informationen om molekylære mekanismer er af væsentlig
interesse, som fx i beskrivelsen af genetisk variations indflydelse på dyrets
fysiologi, eller i et sygdomsforløb, hvor ny viden om molekylære mekanismer vil
kunne bruges til bedre og tidligere diagnostik.
Mange biomarkøranalyser tager udgangspunkt i en sammenlignende
kvantitativ proteomanalyse. For at opnå et kvantitativt mål for proteiners
ekspressionsprofil, anvendes N-terminal opmærkning af proteinernes peptider (en
iTRAQ-mærkning), der er unik for hvert enkelt dyr i en sammenligning. Denne
teknologi tillader, at op til fire individuelle proteomer kan kombineres og
analyseres sammen, hvilket reducerer den tekniske variation imellem prøverne
meget. Arbejdsgangen i en typisk komparativ LC-LC-MS/MS analyse er vist i Figur
3.
 |
Figur 3. Arbejdsgangen i en kvantitativ proteom screening for ændringer
i tarm epitelet hos pattegrise: Vævsprøver udtages fra tarmepitelet fra dyr der
enten har E.Coli kolonisering, eller en steril mave-tarm kanal. Proteinerne
ekstraheres og klippes med trypsin, således at peptid masserne bliver optimale
for ESI-MS/MS analyse. Peptider mærkes N-terminalt (hver prøve med sin unikke
mærkning), og de fire proteomer kombineres. Efterfølgende analyser foretages
fra denne 4-plex prøve. Gentagne serier af HPLC-fraktionering efterfulgt af
serier med skiftevis MS og MS/MS analyser i et quadrupol-TOF masse spektrometer
giver både sekvens information og et mål for relativ protein ekspression af de
enkelte proteiner i de enkelte dyr. Hermed opnår vi information om hvilke
molekylære mekanismer der er involveret i tarmepitelets samspil med
bakteriekolonien. |
Proteomanalyser af tarmsundhed i svin
Infektioner er et væsentligt problem i industriel husdyrproduktion. I
svineproduktionen er det især infektioner i luftvejene, og mave-tarm kanalen,
der ligger til grund for en meget stor del af landbrugets antibiotikaforbrug,
og en forbedret tarmsundhed hos pattegrise er grundlæggende for at kunne
begrænse antibiotikaforbruget i svineproduktionen. Et stort tværfagligt
forskerhold har igennem de seneste fem år sat fokus på at beskrive molekylære
mekanismer, der har betydning for tarm-epitelets udvikling i pattegrise. Ved
hjælp af sammenlignende proteomanalyser har vi beskrevet nogle af
tarm-epitelets mekanismer til optagelse af immunoglobuliner (Ig) og fundet, at
skader på tarm-epitelet hos nyfødte grise indebærer, at dyret mister evnen til
at optage de livsvigtige immunoglobuliner fra soens råmælk (Danielsen et al.,
2006). Videre studier har nu som mål at finde de involverede Ig receptorer.
Dette gennemføres ved hjælp af specifik oprensning af membranfraktioner fra
pattegrisens tarm-epitel, hvorefter LC-MS/MS bruges til specifikt at beskrive,
hvilke membranproteiner der er til stede i de enkelte dyr.
Patogene såvel som gavnlige mikroorganismer i den nyfødtes tarm har
også stor betydning for tarm-epitelets udvikling, og vi har nu adgang til en
lang række infektionsmodeller, hvor nyfødte grises tarme koloniseres med
kontrollerede bakteriestammer (gnotobiotiske dyremodeller). Ved hjælp af
proteom- og microarray-teknologier foretages nu en detaljeret beskrivelse af
ændringerne i tarm-epitelet som følge af forskellige bakteriestammers
tilstedeværelse. Til disse studier bruges iTRAQ-baseret kvantificering af
proteomer, således at ikke kun de ændrede proteiner, men også de stabilt
udtrykte proteiner, bliver identificeret og kvantificeret ved hjælp af meget
detaljerede MS og MS/MS analyser. Figur 3 viser arbejdsgangen i hvorledes
molekylære markører relateres til infektionsmodellerne. Disse studier er med
til at skabe ny viden om molekylære mekanismer i pattegrisens tarmudvikling, og
vil på sigt være med til at reducere infektionsproblemer i svineproduktionen.
Kødkvalitet, et komplekst biologisk problem:
Kvaliteten af det kød, vi køber i supermarkedet, er et resultat af et
komplekst samspil imellem produktionsvilkår, dyrets genetik og slagteriernes
procesteknologi, hvilket gør, at slagterierne har meget svært ved at måle og
klassificere kvaliteten på alt det kød, der processeres og sælges. Nogle
vigtige kødkvalitetsegenskaber er dyrets muskeltilvækst, kødets smag, mørhed,
vandbindingsevne og fedtprocent. Det er klart, at variation i en lang række
gener ligger til grund for variationer i kødkvalitet, men også en række
enkeltgener med meget stor effekt på veldefinerede kødkvalitetsegenskaber er i
dag kendte. Studier af dyr, der bærer variation i disse enkeltgener, er derfor
særligt informative i jagten på relevante biomarkører for kødkvalitet. Proteomstudier af disse dyrs
muskelmetabolisme har igennem flere år været en været en oplagt indgangsvinkel,
eksempelvis hos Hedegård et al. (2004), der igennem sammenlignende
proteomanalyse viser, hvorledes balancen i cellulær respiration er ændret i
muskelen hos svin, der bærer en mutation i AMPK-genet.
For kødindustrien er kendskabet til og optimering af kødets mørhedsgrad
af meget stor kommerciel interesse, og markører, der kan forudsige, hvorledes
mørheden udvikles i kødet under modning, er også et vigtigt forskningsområde,
dels for at kunne optimere på de teknologiske processer i slagterindustrien,
dels for at kunne anvende pålidelige mærkningssystemer, således at forbrugeren
får en kendt og ensartet kvalitet. DJF’s forskere har igennem de seneste år
deltaget i en lang række proteomprojekter, der har belyst nogle af de protein-
og peptidmønstre, der ændres i kødet under mørningsprocessen. Nogle af de
fundne markører relaterer til mørhedsudviklingen i kødet, og en videre
beskrivelse af, hvorledes disse markører kan bruges informativt i
kødindustrien, forløber nu i samspil med internationale samarbejdspartnere. For
et review omkring brugen af proteomics i kødforskningen henvises til Bendixen
(2006).
Svinet som modelorganisme for humane sygdomme
Både fysiologisk og genetisk set er svin tættere beslægtet med
mennesket end de dyr (oftest mus og rotter), der i dag bruges i stor
udstrækning til dyremodeller for humane sygdomme. Igennem mange års genetiske
og fysiologiske karakteriseringer af svin har vi adgang til dyr, der kan
udnyttes til modelstudier, måske specielt til metabolisme og fedmeforskning.
Danmark producerer hver år 20 mio. slagtesvin, hvilket udgør et fantastisk
potentiale i etablering af bedre dyremodeller for humane sygdomme. Også kloning
og markørbaseret avl er med til at øge potentialet for at udvikle modeldyr for
humane sygdomme.
Beskrivelsen af modeldyrenes proteom ekspression er et vigtigt led i
forståelsen af sygdomsmekanismerne. Igennem de seneste år har vi gennemført en
lang række karakteriseringer af både lever-, muskel-, lunge- og tarm-proteomet
fra svin, og igennem projekterne opbygget viden og robuste teknologiplatforme,
der gør DJF stærkt rustet til at karakterisere biomarkører, også svinemodeller
for humane sygdomme.
Referencer:
Bendixen, E., (2006) The use of proteomics in meat
science (Review) Meat science, 71, 138-149
Danielsen, M., Thymann, T., Jensen, B.B., Jensen, O.N. Sangild, P.T., and Bendixen, E.
(2006)
Proteome profiles of mucosal immunoglobulin
uptake in neonatal porcine gut. Proteomics, (in press)
Hedegaard, J., Horn, P., Lametch, R., Møller, H., Roepstorf, P., and Bendixen (2004) UDP-glucose pyrophosphorylase is upregulated in carriers of the porcine RN mutation
in AMP-activated protein kinase. Proteomics, 4, 2448-2454
Fodnote:
Forkortelser: MALDI-TOF: Matrix-assisted laser desorption-ionization
time-of-flight; LC: Liquid chromatography; HPLC:High pressure liquid chromatography; ESI: Electrospray ionisering; MS:
Masse spektrometri; MS/MS: Tandem masse spektrometri.
|
