En Verden bestående af RNA molekyler

Henrik Nielsen, Institut for Medicinsk Biokemi og Genetik, Panum Instituttet, København, hamra@imbg.ku.dk

”RNA Verden” hypotesen er en hypotese om en verden forud for eksistensen af cellulært liv. En verden, hvor RNA spillede hovedrollen som bærer af genetisk information og katalysator af biokemiske processer. RNA molekyler var i denne verden genstanden for darwinistisk evolution på vejen til det liv, vi kender i dag. Hypotesen fik for alvor vind i sejlene med opdagelsen af katalytisk RNA for lidt over 25 år siden og er i dag alment accepteret. RNA Verdenen dateres til ca. 4 milliarder år tilbage i tiden. Som forskningsområde er det lidt af en intellektuel udfordring at beskæftige sig med for der er ingen konkrete vidnesbyrd om de historiske begivenheder, som man ønsker at afdække. Dette til trods har hypotesen om RNA Verdenen vist sig at åbne vejen for megen indsigt, ikke mindst i nutidige organismers molekylære biologi.  

Løsningen på et tilsyneladende paradoks

Replikation af DNA forudsætter medvirken af RNA og protein. Og syntesen af RNA og protein forudsætter medvirken af DNA. Dette ”ægget og hønen” problem fik sin løsning i begyndelsen af 80’erne med to opdagelser af RNA enzymer (ribozymer). Tom Cech viste, at en gruppe I intron i genet for ribosom RNA i ciliaten Tetrahymena kan katalysere sin egen udsplejsning. Sidney Altman viste at RNA-komponenten af enzymet RNase P alene kan kløve tRNA molekylers 5’-ende i fravær af den protein-komponent, som den ellers er associeret med. De to opdagelser viste at RNA, som det eneste af cellens makromolekyler, både kan fungere som genetisk materiale og som katalysator af biokemiske reaktioner. Det var dette argument mere end noget andet der banede vejen for ”RNA Verden” hypotesen, en hypotese der i sin mindst stringente udformning udsiger, at der før udviklingen af DNA og proteiner var en periode i udviklingshistorien, hvor livsytringer var baseret på RNA.  Sådanne tanker havde allerede været fremsat gennem 60’erne af fremtrædende forskere som Alexander Rich, Leslie Orgel, Carl Woese og Francis Crick. RNA er et godt materiale for darwinistisk evolution. Trods den simple opbygning kan RNA danne komplicerede rumlige strukturer stabiliseret af to typer af basepar. Standard Watson-Crick basepar, der også kendes fra DNA, bruges fortrinsvis til at lave et regelmæssigt skelet af duplexer, hvor den primære sekvens er af mindre betydning. Leontis-Westhof basepar, af hvilke der findes mange typer, bruges til at lave mere sofistikerede arkitektoniske elementer i molekylet og til at præsentere funktionelle grupper i nukleotidbaserne for omgivelserne. Små ændringer i RNA sekvensen kan føre til dramatiske ændringer i strukturen og udgøre grundlaget for udvikling af nye funktioner ved selektion.

7 gode argumenter

En anden vigtig figur i udforskningen af RNA Verdenen, Gerald Joyce, opregnede i en artikel i 1989 syv gode argumenter for RNA Verden hypotesen (Tabel 1). De to første var de ovenfor nævnte centrale observationer, at RNA kan fungere som genetisk template og som katalysator. Det tredje argument var det alment kendte forhold, at RNA spiller en central rolle i alle basale processer der har med forarbejdning af genetisk materiale at gøre. Det vil sige replikation (som primer), transskription, splejsning og translation. De resterende argumenter er hentet fra stofskiftebiokemien og afslører, at proteiner og DNA er kommet til senere end RNA. De fleste af proteinenzymernes coenzymer er nukleotider eller er syntetiseret ud fra nukleotider. Histidin, som er involveret i det katalytiske center af mange enzymer syntetiseres ligeledes ud fra et nukleotid. Hvad angår DNA, så laves deoxynukleotiderne ved reduktion af ribonukleotider (altså RNA byggestene) og syntesen af dTTP, som er særegen for DNA, laves via methylering af dUTP, hvor UTP er særegen for RNA. I 2000 kom så det ottende argument, der af mange betegnes som ”the smoking gun”. Røntgenkrystallografiske undersøgelser af ribosomet viste at det sted, hvor peptidbindingerne laves ligger dybt begravet i ribosomets RNA del, langt fra nærmeste ribosomale protein. Eller med andre ord – ribosomet er også et ribozym. 

Ét ribozym, mange ribozymer

Opdagelsen af katalytiske RNA molekyler var en ”øjenåbner”, og den slags fører ofte til en række af beslægtede opdagelser. Men det skete ikke i dette tilfælde og 25 år efter beskrivelsen af de første to ribozymer er listen over naturligt forekommende ribozymer på kun 12 forskellige typer og det er en meget mærkelig liste. I den ene ende findes ribozymer, som er helt centrale for nutidige cellers funktion. Det drejer sig naturligvis først og fremmest om ribosomet, men også om RNase P og spliceosomet, som varetager udsplejsning af den mest almindeligt forekommende type af introner i eukaryoter. I den anden ende findes en blanding af mere eller mindre eksotiske ribozymer. Det er de små kløvningsribozymer, som fortrinsvis er fundet i planteviroider (små RNA molekyler, der inficerer planter), men også kendes fra transskriptionsterminering af -globin transskription hos mennesket og fra regulering af mRNA turn-over i bakterier. Endelig er der to typer af selvsplejsende introner. Den oprindelige type, gruppe I ribozymerne, og gruppe II ribozymerne, der udsplejser introner på en måde, der kemisk set er magen til spliceosomets splejsning. Begge disse typer af ribozymer findes i mikroorganismer og i organellers genomer.

Man kan vel sige, at listen over naturligt forekommende ribozymer ikke bestyrker tiltroen til RNA molekylers potentiale for at understøtte den mangfoldighed af processer, der i sidste ende skulle føre til cellulært liv. Det problem fik sin løsning ved indførelsen af in vitro evolution som metode omkring 1990. I denne metode starter man med en pulje af RNA molekyler med randomiseret sekvens. Molekylerne udsættes for en udvælgelsesproces, som fx kan være binding til en ligand eller katalysering af en reaktion. De succesfulde molekyler udskilles og mangfoldiggøres, hvorpå den berigede pulje underkastes en ny runde selektion. Efter et antal selektionsrunder klones og karakteriseres ”vindermolekylerne”. Ved denne metodik er listen af naturlige ribozymer blevet udvidet betragteligt med menneskeskabte ribozymer. Ribozymer kan katalysere de fleste trin i syntesen af puriner og pyrimidiner og dermed lave deres egne byggestene. Andre ribozymer kan fungere som polymeraser og dermed syntetisere nye RNA kopier. Ribozymer kan også aminoacylere tRNA molekyler og katalysere dannelsen af peptidbindingerne således som man måtte forvente ud fra studier af ribosomet. Ribozymer kan desuden katalysere mange forskellige kemiske reaktioner, såsom dannelse af C-C bindinger, hydrolyse af estre,  alkyleringer, redox-processer (alkohol dehydrogenase) og fosforyleringer . De fleste ribozymer der er udviklet ved in vitro evolution er langsommere end deres modsvarende protein-enzymer, men de er også meget mindre. Så den mest slående konklusion er at RNA, til trods for den meget begrænsede kemiske diversitet i de fire nukleotider, er i stand til at katalysere en bred vifte af processer.

Men der mangler fortsat en replikase

En grundlæggende forudsætning for RNA Verdenen er en replikase, der kan replikere RNA genomer. Men her støder idéen på et nyt paradoks. For at opretholde et RNA genom, der er tilstrækkeligt stort til at kode for ribozymer, skal der foreligge en sofistikeret replikase med en lav fejlrate. Men for at en sådan kan opstå, skal der foreligge et genom af en vis størrelse. Med det ret omfattende kendskab man i dag har til ribozymer, er det forventeligt, at en replikase skal have en kædelængde på mindst 100 nukleotider. Imidlertid er det ikke muligt at der har foreligget en pulje med alle tænkelige RNA molekyler af en kædelængde på 100 nukleotider forud for replikasens udvikling. For det første er det utænkeligt at så lange kæder vil kunne opstå spontant. For det andet er der 4100 forskellige muligheder svarende til ca. 1060 molekyler. De ville tilsammen have en masse der er 1013 gange Jordklodens masse! Et andet fundamentalt problem, som oprindeligt blev påpeget af Manfred Eigen, vedrører fejlraten. Replikationsfejl er vigtige for darwinistisk evolution, men for at opretholde et genom ved replikation må fejlraten som tommelfingerregel ikke overstige den inverse af genomets størrelse. Nutidige organismer ligger tæt på denne fejlrate med 10-4 i bakteriofager, 10-6 i bakterier og 10-9 i mennesket. RNA Verdenens replikase skulle altså være opstået ud af ingenting med en fejlrate på 1 % og det er helt usandsynligt. Hvad har man så rent faktisk opnået i laboratoriet i forsøg på at udvikle en RNA replikase? Trods en betydelig forskningsindsats er den bedste, der endnu er lavet på ca. 200 nukleotider. Den kan bruge en ekstern template til at syntetisere en kæde på op til 14 nukleotider. Det er den 24 timer om og fejlraten er på 3 %. Det virker som om, at forestillingen om opståen af en RNA replikase er naiv og at der skal helt nye idéer på bordet for at løse dette paradoks. Hvis man ser på præmisserne er der heldigvis mange muligheder. For det første behøver den første RNA replikase ikke at være en template afhængig polymerase. Man kan forestille sig simplere ligaser, der laver kopier af sig selv ved at ligere to oligonukleotider sammen. For det andet er det ikke sikkert, at alle fire nukleotider var repræsenteret fra starten. Der er påvist ligaser med kun tre forskellige nukleotider og endda ribozymer, som kun består af to forskellige nukleotider. Endelig kan replikasen være opstået i et ikke-RNA molekyle i tiden forud på helt andre præmisser end dem der lægges til grund i udvikling af RNA molekyler.

Tiden før og tiden efter

Ved hjælp af fylogenetisk rekonstruktion og geologiske fund kan man slutte sig til, at de første former for cellulært liv må have eksisteret for ca. 3.6 milliarder år siden. Før den tid er det ikke meningsfuldt at slutte sig baglæns til historiske begivenheder og opgaven bliver snarere gennem rekonstruktion at finde mulige veje for den biologiske evolution. Jorden er ca. 4.5 milliarder år gammel og de første par hundrede millioner år har miljøet næppe været stabilt nok til at der kunne foregå en kemisk evolution. Det giver en periode på 600 millioner år til udviklingen af cellen på baggrund af den pre-biotiske kemi. Ét eller andet sted på denne vej skal man forestille sig RNA Verdenen. Der er to skoler hvad angår tiden før RNA. Enten var RNA den første type af molekyler, der kombinerede genetisk information og katalyse eller også fandtes der i forvejen andre former af molekyler, en slags pre-RNA, der både havde disse egenskaber og som ”opfandt” RNA. Hvis det var tilfælde kan man enten forestille sig, at pre-RNA gradvist (i evolutionsmæssig forstand) overførte egenskaber til RNA eller at de var vidt forskellige og at RNA simpelthen ”tog over” fordi det var et mere effektivt molekyle.

Det er langt lettere at redegøre for vejen fra RNA Verdenen til DNA- og protein-baseret liv. RNA kan katalysere alle de reaktioner, der er nødvendige for at lave den form for proteinsyntese, der kendes fra nutidige celler. Opfindelsen af proteiner var sikkert den væsentligste begivenhed i RNA Verdenen fordi aminosyrerne rummer en meget større kemisk diversitet og dermed er meget bedre til at katalysere en bred vifte af processer. På en måde har opfindelsen af peptider dermed været begyndelsen til enden på RNA Verdenen. Umiddelbart er det mest sandsynligt, at DNA er kommet efter protein. RNA kan katalysere polymeriseringen af DNA, men næppe bringes til at katalysere den nødvendige reduktion af ribose til deoxyribose. Det er dog muligt at syntesen af DNA byggestene har fulgt en helt anden vej end den vi kender i dag. En anden vigtig begivenhed i udviklingen var kompartmentalisering. Den kunne være foregået i form af dannelse af membranvesikler, men der er mange andre muligheder. Man kan forestille sig adsorption til overflader, sprækker i klipper, aerosoler eller ligefrem at RNA selv dannede aggregater i lighed med moderne ribosomer, hvor forskellige små molekyler kunne findes i høj koncentration og i miljøer, der var forskellige fra omgivelserne. 

Et nyt ribozym på scenen

Figur 1. (A) GIR1 ribozymet kløver sig selv og efterlader det ene fragment med en løkke i enden. Reaktionen er reversibel. (B) Dannelsen af løkken betyder at bindingsenergien er bevaret ved kløvningen. Ved gentagne kløvninger og ligeringer vil forskellige typer af RNA molekyler med GIR1 aktivitet kunne danne nye kombinationer.

For nylig beskrev vi et nyt ribozym, der katalyser dannelse af en lille løkke i den ene ende (5’-enden) af RNA-kæden (Figur 1A). Reaktionen er kemisk set magen til første trin i udsplejsning af introner i højere eukaryoter. Men her er det et selvstændigt RNA molekyle der katalyserer reaktionen og ikke spliceosomet (som dog formodentlig også indeholder en katalytisk RNA del). Tilmed er løkken ganske kort idet det er kædens første og tredje nukleotid der er forbundne (med en 2’, 5’-fosfordiester binding). Den særlige struktur har som funktion at beskytte den mRNA som den sidder på mod nedbrydning og er muligvis også involveret i translation. Som det fremgår af ovenstående er det ikke hverdagskost at finde et nyt, naturligt forekommende ribozym. Fortæller det os så noget nyt om RNA Verdenen? For det første er det interessant, at vi kan se at det nye ribozym, kaldet GIR1, er udviklet fra en selvsplejsende gruppe I intron. Oven i købet fra en ganske bestemt undergruppe og sandsynligvis ved at der er sket en fejl i en splejsningsreaktion, som har medført at ribozymet har ”siddet fast” og derigennem erhvervet en ny egenskab. Det er interessant, at spliceosomale introner kan være udviklet på simpel måde fra gruppe I introner og særligt, hvis alt der skulle til var en lille fejl. Udsplejsning af introner er en fundamental proces i udviklingen af mangfoldighed i genekspression i eukaryoter, både hvad angår selve udviklingen af generne og hvad angår dannelsen af mange produkter fra ét gen ved hjælp af alternativ splejsning. Der er to andre interessante aspekter ved dannelsen af den lille løkke i enden af RNA kæden. For det første kan det have været vigtigt at beskytte molekylets ende på denne måde i RNA Verdenen. For det andet dannes løkken ved en transesterificering, hvor der brydes en binding (kæden klippes over) og dannes en binding (forgreningen i løkken). Herved bevares bindingsenergien således at tilbagereaktionen let kan forløbe. I det naturlige system er der en mekanisme, der sikrer at reaktionen løber den rigtige vej, men reaktionen kan let bringes til at løbe så effektivt tilbage at man slet ikke ser fremad reaktionen. Det betyder, at GIR1 formodentligt vil kunne rekombinere RNA molekyler og dermed skabe nye typer (Figur 1B). En vigtig funktion i RNA Verdenen?

Refleksion

Én af de fascinerende ting ved forskning er, at man ofte ikke er helt klar over, hvad man egentlig forsker i. Cech og Altman arbejdede med molekylærbiologiske fænomener i nutiden, men opdagede en dybere sandhed om fortiden. Ribozymforskerne, der har forsøgt at rekonstruere RNA Verdenen, opdagede vigtige fænomener i nutidige organismer (fx riboswitches) og har været drivkraften i et væld af meget nutidige anvendelser af RNA molekyler som værktøjer, fx i genterapi. Under alle omstændigheder indvarslede Cech og Altmans opdagelser en æra i biologien, hvor RNA molekyler spiller en central rolle. Med de seneste års fantastiske opdagelser af RNA molekylers mangfoldighed og mange essentielle funktioner i cellen kan man nu ikke bare tale om RNA Verdenen, men også om en Verden af RNA molekyler.

Udvalgt litteratur

Joyce GF. The antiquity of RNA-based evolution. Nature 418:214-21 (2002).

Joyce GF. RNA evolution and the origins of life. Nature 338:217-24 (1989).

Muller UF. Re-creating an RNA world. Cell Mol Life Sci. 63:1278-93 (2006).

Nielsen H, Westhof E, Johansen S. An mRNA is capped by a 2’, 5’ lariat catalyzed by a group I-like ribozyme. Science 309:1584-7 (2005).

Szostak JW, Bartel DP, Luisi PL. Synthesizing life. Nature 409:387-90 (2001).