Siden sidst

Et bredt udsnit

Kresten Lindorff-Larsen og Peter Brodersen. klindorff-larsen@aki.ku.dk; peter.brodersen@ibmp-ulp.u-strasbg.fr

I denne omgang siden sidst har fundet en række artikler, der viser et bredt udsnit af dansk molekylær biologisk og biokemisk forskning. Vi har denne gang valgt at fokusere på en historie om hvordan gær celler føler deres omgivelser.

Hvordan måler cellen et koncentrationsforhold?

Competitive intra- and extracellular nutrient sensing by the transporter homologue Ssy1p

J Cell Biol 173 (2006): 327-331

B Wu, K Ottow, P Poulsen, RF. Gaber, E Albers, and MC. Kielland-Brandt

Et grundliggende vilkår for liv som vi kender det, er at en organisme skal kunne adskille dens indre fra dens ydre. I praksis betyder det at såvel enkelt- som fler-cellede organismer begrænser deres indre med en cellemembran. Selvom der selvfølgelig er en lang række fordele ved at adskille sig fra omverden med en membran, så giver det også en række problemer. Et åbenlyst problem er at cellen ikke direkte har adgang til de næringsstoffer, der findes i omgivelserne, idet disse som regel ikke kan krydse membranen af sig selv. For at løse dette problem har naturen udviklet en lang række transport systemer, der spænder fra passiv diffusion til aktiv transport. Fælles for disse systemer er, at de fungerer ved at cellen producerer et transportprotein, som lokaliseres til den membran der skal krydses. Et åbenlyst spørgsmål er så hvilke transportproteiner en celle skal producere på et givent tidspunkt. En celle, som f.eks. gæren Saccharomyces cerevisiae, der er brugt som model i dette studium, kan jo i princippet møde en lang række forskellige næringsstoffer, men det vil være fornuftigt kun at producere transportører for de få stoffer den i praksis møder på et givent tidspunkt.

For at løse dette problem kan transportsystemer suppleres med sensorproteiner, hvis funktion det er at undersøge hvilke stoffer der findes i omgivelserne. Det virker måske som at fjerne et problem for at skabe et nyt, for så skal cellen producere sensor proteiner mod en lang række stoffer. Men i modsætning til transportører, så kan sensor proteiner udøve deres funktion selvom de kun er til stede meget få kopier, og dermed behøver cellen ikke bruge så meget energi på at lave store mængder irrelevant protein. Når sensorproteinet aktiveres af et givent stof kan det sætte en signaltransduktionsvej i gang, der for eksempel kan forårsage at der produceres en transportør til det sensede stof.

Tidligere troede man at mange sensorer fandtes inden i cellen, men intracellulære sensorer giver det problem at de kun kan måle den intracellulære koncentration, der jo kun indirekte er et mål for mængden i det omkringliggende medium. Senere har man fundet, bl.a. med bagegær som modelorganisme, at flere sensorer ligesom transportør proteinerne findes i cellemembranen. Særdeles interessant er en gruppe sensorproteiner, der har homologi til transportproteinerne. Blandt disse sensorer findes i bagegær proteinet Ssy1p, der er et membranprotein med 12 transmembrane segmenter, og hvis funktion det er at sense aminosyrer i omgivelserne. Ssy1p har 20-30% sekvensidentitet til en række aminosyre permeaser, men mens disse permeaseproteiner kan transportere forskellige aminosyrer, har Ssy1p ingen transport aktivitet.

Sensorproteiner som Ssy1p ligner altså transportører for de stoffer, som de skal sense. Man kunne derfor tro at mekanismen for deres funktion simpelthen var at de bandt stoffet, i dette tilfælde en aminosyre som for eksempel leucin, i et ekstracellulært bindingssite, der var identisk med det site som en homolog permease ville benytte til at binde og transportere leucin. Den ekstracellulære binding kunne så give ophav til en konformationel ændring af sensoren, der ville resultere i intracelluær signalering. Selvom visse sensor proteiner måske fungerer på denne måde, så er problemet at cellen kun kan respondere på den ekstracellulære koncentration, uafhængigt af hvad koncentrationen inde i cellen er. I stedet for en sådan mekanisme kunne man forestille sig, at det ville være mere relevant for cellen kun at sætte signaleringen i gang, hvis forholdet mellem den ekstracellulære og den intracellulære koncentration oversteg en given grænse. Og det er netop en mekanisme til at måle sådanne koncentrationsforhold at forskerne fra Carlsberg Laboratorium har fundet i aminosyre sensoren Ssy1p.

Ssy1p kan sense forskellige aminosyrer, men forskerne fra Carlsberg fokuserer i artiklen på leucin, der er den mest potente aktivator af Ssy1p-medieret signalering. Leucin aktivering af Ssy1p starter en signaleringskaskade, der blandt andet involverer transkriptionsaktivatoren Stp1p. Ved aktivering af Ssy1p kløves Stp1p, og denne observation gav forskerne et stærkt assay til at kvatificere graden af Ssy1p signalering: ved at måle forholdet mellem kløvet og intakt Stp1 i western blots fås et direkte mål for Ssy1p signalering. Som forventet stiger signaleringen, målt på denne måde, hvis den ekstracellulære koncentration af leucin forøges; det er jo netop hele meningen ved en sensor. Og med baggrund i den kvantitative analyse af signalering kan forskerne måle at cellerne under normale vækstbetingelser opnår 50% aktivering når den ekstracellulære koncentration af leucin er 13 micromolær. Det er under disse betingelser altså en ganske følsom sensor.

Hvad sker der så hvis gæren allerede har masser af leucin i cellen? Man kunne måske tro at den var mindre interesseret i at starte signaleringen og dermed produktionen af aminosyretransportører. For at teste denne hypotese gennemgår forskerne en tour-de-force af eksperimenter under forskellige vækstbetingelser og i forskellige mutant baggrunde. Hvis gæren for eksempel vokser i et medium med 1mM leucin, så stiger den intracellulære leucin koncentration 50 gange i forhold til eksperimentet ovenfor. Og hvis man vasker denne leucin bort og måler på signaleringen, så skal der nu 5 gange så meget leucin til at aktivere Ssy1p som ovenfor. I et andet elegant eksperiment forøger forskerne den intracellulære koncentration af leucin ved at foretage eksperimenterne i en mutant form af gær, der ikke har feedback inhibering af sin leucin biosyntese. Også i dette eksperiment viser det sig at hvis den intracellulære koncentration af leucin stiger, så skal der mere ekstracellulært leucin til at aktivere Ssy1p. Disse og en række lignende eksperimenter viser altså at det ikke kun er den ekstracellulære, men også den intracellulære koncentration af leucin, der bestemmer hvor stor grad af signalering der sættes i gang.

Med udgangspunkt i at Ssy1p ligner en aminosyre permease, foreslår forskerne en molekylær mekanisme, der kan forklare disse observationer. De foreslår at Ssy1p, ligesom permeaserne, kan findes i to tilstande, og at der er en ligevægt mellem disse tilstande. I den ene tilstand er et bindingssite eksponeret til det ekstracellulare medie, mens sensoren i den anden tilstand eksponerer et bindingssite indadtil; liganden kan kun binde til et site ad gangen. På den måde kan intra- og ekstra-cellulær ligand konkurrere med hinanden om bindingen til sensoren. Den aktive signaleringskonformation er den hvor liganden er bundet ekstracellulært, og affiniteten for ekstracellulært leucin til denne konformation er ganske høj. Men hvis den intracellulære koncentration af leucin er tilstrækkelig høj kan den forskyde ligevægten mellem de to konformationer, og på den måde mindske den effektive affinitet for ekstracellulært leucin - fuldkommen som observeret eksperimentelt. Modellen passer også godt til tidligere mutationsstudier, hvor en konstitutivt aktiv form af Ssy1p fortolkes som en form hvor ligevægten er forskudt mod den aktive konformation. En anden interessant mutation i Ssy1p forskyder den effektive affinitet for en række forskellige aminosyrer på samme tid. Dette kunne principielt skyldes en mutation i et bindingssite, men observationen at alle aminosyrer påvirkes stort set ens forklares bedre ved en effekt på en sensorens ligevægt mellem signalerende og ikke-signalerende.

Med disse studier har forskergruppen nu opstillet en ny model for hvordan transportør-lignende sensor proteiner fungerer. Modellen forklarer hvorledes aktivering både er afhængig af den intra- og ekstra-cellulære ligand koncentration. Udover aminosyre sensorer kendes der også for eksempel transportør-lignende glucose sensorer, og det bliver interessant at se om en lignende mekanisme kan forklare hvorledes disse sensorer fungerer.

Andre artikler

Modulatory and catalytic modes of ATP binding by the calcium pump
EMBO J 25 (2006): 2305–2314
AM Lund Jensen, T Lykke-Møller Sørensen, C Olesen, J Vuust Møller, P Nissen

RNA-binding IMPs promote cell adhesion and invadopodia formation
EMBO J 25 (2006): 456–1468
J Vikesaa, TVO Hansen, L Jønson, R Borup, UM Wewer, J Christiansen, and FC Nielsen

A unique set of SH3–SH3 interactions controls IB1 homodimerization
EMBO J 25 (2006): 785–797
O Kristensen, S Guenat, I Dar, N Allaman-Pillet, A Abderrahmani, M Ferdaoussi, R Roduit, F Maurer, JS Beckmann, JS Kastrup, M Gajhede, C Bonny

Resource: A Wiring of the Human Nucleolus
Molecular Cell 22 (2006): 285-295
AM Hinsby, L Kiemer,  EO Karlberg,  K Lage,  A Fausbøll,  AS Juncker,  JS Andersen,  M Mann, S Brunak

Resource: A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling
Cell 125 (2006): 187-199
LJ Foster, CL de Hoog, Y Zhang, Y Zhang,  X Xie, VK Mootha, M Mann

Genome-wide mapping of Polycomb target genes unravels their roles in cell fate transitions
Genes & Dev 20 (2006): 1123-1136
N Dietrich, D Pasini, KH Hansen, K Helin

Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks
J Cell Biol 173 (2006): 195-206
S Bekker-Jensen, C Lukas, R Kitagawa, F Melander, MB Kastan, J Bartek, J Lukas