Den klassiske
selektion af avlsdyr i husdyrproduktionen er stort set baseret på fænotypiske observationer. Med moderne molekylær-genetiske
metoder anvendt på avancerede avlsprogrammer er det
blevet muligt at identificere og udnytte den specifikke genetiske variation bag
den observerede fænotypiske variation. Dette muliggør
en mere specifik selektion af avlsdyr, specielt i forbindelse med komplekse
fænotyper, som f.eks. sygdomsresistens og andre egenskaber med en lav heritabilitet, der er vanskellige at avle for med den
klassiske selektion. Som et eksempel på forskningen indenfor dette område, vil
arbejdet med at identificere gener, der er relateret til forekomsten af
ondartet lungesyge hos svin, blive præsenteret.
Ondartet
lungesyge hos svin
 |
Figur 1. Tre stadier af Ap infektion: akut
(nederst), subakut/kronisk (midten) og kronisk
(øverst). Billedet er fra ”USK Udvidet SundhedsKontrol på slagtedyr” Gorm Christensen, Landsudvalget for
svin, Danske Slagterier, 1997 og er gengivet med tilladelse fra Danske
Slagterier. |
Infektioner af luftvejene er et af de hyppigst forekommende problemer i
den moderne svineproduktion. En af disse infektioner er ondartet lungesyge, som
er en smitsom form for lungebetændelse. Ondartet lungesyge forårsages af den
Gram-negative bakterie Actinobacillus pleuropneumoniae (Ap) og kan føre
til omfattende skader på lungefunktionen da det inficerede lungevæv dør. Er større områder af lungen inficeret kan dyret dø i løbet af få timer,
hvis det ikke behandles. Infektionen forløber typisk over 3-4 uger startende
med en akut infektion som udvikler sig indenfor de første få døgn. Herefter
heler det inficerede væv op til en kronisk infektion (figur 1).
Da betændelsen også omfatter lungehinden ses det ofte at lungerne gror
fast til brysthulen. Dette betegnes brysthindear og
observeres hyppigt i forbindelse med slagtningen af svin fra smittede
besætninger. Se (Taylor, 1999) for yderligere information om Ap.
Genetisk
variation og egenskaber
Af hensyn til dyrenes velfærd og produktionsomkostningerne er det
ønskværdigt at nedbringe hyppigheden af ondartet lungesyge. Ondartet lungesyge
forebygges ved at optimere eksempelvis indretning, miljø og drift. Der er
endvidere udviklet vacciner til brug for forebyggelse af infektioner. En oplagt
mulighed vil dog være at fremavle dyr med forøget resistens imod sygdommen.
I 1998 iværksatte Landsudvalget for Svin, Danske Slagterier, i
samarbejde med Danmarks JordbrugsForskning (DJF),
Afd. for Genetik og Bioteknologi, projektet ”Avl for Sundhed”, som havde til
hensigt at skabe et grundlæggende materiale til beskrivelse af den genetiske
variation i den aktuelle danske svinepopulation. Den hypotese, som blev testet
ved hjælp af det indsamlede materiale i projekt ”Avl for Sundhed”, var, hvorvidt
der i de udvalgte racer nedarves varianter af gener eller genkomplekser, som
giver en signifikant effekt på grisenes resistens imod sygdomme samt forbedrer
grisenes produktions- og kødkvalitetsegenskaber. Materialet er indsamlet i et
forsøgsdesign, som optimerer muligheden for at finde sådanne gener eller
genkomplekser og involverede 12 orner, der krydset med ca. 800 søer resulterede
i et afkom på ca. 12.000 dyr. Alle dyr blev fulgt og registreret under
opvæksten og ved slagtning, ligesom der blev udtaget mere end 40.000 blod og
vævsprøver.
På baggrund af de indsamlede data blev der påvist forskelle i
sygdomsfrekvens og produktionsresultater såvel mellem som inden for kuld. Denne
genetiske variation er en forudsætning for igangsættelsen af et genomscan med henblik på at lokalisere gener og
genkomplekser i svinets genom, som ligger til grund for de observerede fænotypiske forskelle i f.eks. resistens imod ondartet
lungesyge. Relationen mellem genetisk og fænotypisk variation er ligeledes blevet undersøgt ved at studere ekspressions-profilerne
i lungevæv og relatere disse til forskellige
observationer.
For at karakterisere grisens immunsystem nærmere og studere det
umiddelbare respons på infektion med Ap, er der i
samarbejde med Danmarks Fødevare og Veterinær Forskning blevet gennemført et
infektionsforsøg, hvor ekspressions-profilerne af inficerede og kontrol dyr er
blevet analyseret.
Der er karakteriseret 15 forskellige serotyper of Ap og de almindeligst
forekommende serotyper i Danmark er serotype 2, og 6. Under anvendelse af den nyeste sekventeringsteknologi har vi sekventeret det komplette genom af Ap serotyperne 2 og 6 blevet bestemt med henblik på bl.a. en beskrivelse af forskelle i
virulens mellem serotyper.
DJFs deltagelse i det Dansk-Kinesiske Svine Genom Projekt (Jorgensen et al., 2005; Wernersson et al., 2005) er en del af
grundlaget for gennemførelsen af de ovennævnte studier, idet projektet har
resulteret i genmarkører til brug for et genomscan samt et stort antal cDNA kloner til fremstilling af cDNA microarrays (figur 2).
 |
Figur 2. Microarray (DIAS_PIG_55K3_v1) hybridiseret med Alexa-488 opmærket grise lever RNA.
Forstørret ses et enkelt sub-array ud af i alt 48.
DIAS_PIG_55K3_v1 består af 55.548 spots: 26.877 PCR produkter fra cDNA kloner og 867 kontrol spots, alle printet i duplika som nabospots i et 4x12 array af sub-arrays, som hver består af 34x34 spots. cDNA klonerne blev udvalgt fra cDNA bibliotekerne lavet i forbindelse med det Dansk-Kinesiske Svine Genom Projekt ved hjælp af BLASTN (P ≤ 10-8) således at flest
mulige humane gener i NCBI’s RefSeq database, release 15 var repræsenteret. Derudover
blev der udvalgt en række cDNA kloner som
repræsenterede ikke karakteriserede gener og mulige svine-specifikke gener.
Kontrol spots består af ”positive” spots, blanke (spotting buffer) og udvalgte
spots fra Lucidea Universal ScoreCard (GE Healthcare). Arrays er printet på UltraGAPS slides (Corning Incorporated) med en SDDC-2 MicroArrayer (BioRad) med 48 x 946 MP2.5 spotting pins (Telechem International).
Et oligonukleotide baseret microarray er p.t. under produktion. Microarrayet består af
24.710 oligonukleotider (70-mer) designet til hver at
repræsentere et grise gen samt et antal kontrol
elementer. Oligonukleotiderne var designet med
programmet SEPON (Hornshoj et al., 2004) og OligoArray 2 (Rouillard et al.,
2003).
Yderligere information om cDNA microarrays fremstilles ved DJF kan findes på GeneExpression Omnibus (http://www.ncbi.nih.gov/geo/) under
accession numrene GPL3594 (DIAS_PIG_27K2_v2), GPL3585 (DIAS_PIG_55K2_v1) og
GPL3608 (DIAS_PIG_55K3_v1).
|
Identifikation af Gener (QTL) med indflydelse på resistens imod
ondartet lungesyge
Alle 12.000 dyr fra projektet ”Avl for Sundhed” er blevet
genotypebestemt for mere end 750 markører spredt over hele genomet. Et sådant genomscan omfatter typning af
dyrene for et stort antal genmarkører og derefter en analyse af nedarvningen af disse genmarkører ved associationsstudier
og QTL-analyser, hvor de fænotypiske resultater sammenholdes med genmarkørerne i en avanceret biometrisk analyse.
Data fra dette meget store genomscan bliver brugt til
at lokalisere og identificere gener og genkomplekser i svinets genom, der er
årsag til fænotypiske forskelle i sygdomsresistensen.
Studiet involverer mere end 7 millioner genotypninger og har resulteret i fundet af 5 genomiske regioner
(QTL) med signifikant indflydelse på resistensen imod Ap.
Der er i øjeblikket ved at blive planlagt valideringstudier for disse QTLer med henblik på udvikling af
markørbaserede test for selektion af resistente dyr i avlsarbejdet.
Arvelighed i
ekspression
En undersøgelse af arvelige forskelle i genekspression,
vil potentielt kunne bidrage til identifikationen af den specifikke genetiske
variation bag den observerede fænotypiske variation.
For at studere generelle arvelige forskelle i ekspression samt søge at relatere
disse til resistens imod ondartet lungesyge, blev ekspressionsprofiler af lungevæv undersøgt ved hjælp af cDNA microarrays og 2D-protein elektroforese på udvalgte dyr fra ”Avl for Sundhed”. De udvalgte dyr var alle fra den samme
besætning og stammede fra to forskellige orner med høj hhv. lav forekomst af brysthindear hos afkommet. De blev udvalgt således at
forsøget var balanceret med hensyn til de tre faktorer: orne-linie, forekomst
af brysthindear og køn. Ekspressionsprofilerne blev
analyseret og viste, for begge teknikker, at orne-linie havde den største
effekt, mens køn og forekomst af brysthindear havde
mindre effekt. Dette forsøg viser således at der er tydelige arvelige effekter
i ekspressionsprofilerne. En inddragelse af ekspressionsdata i
associationsstudierne vil bidrage til identifikation af gener og genkomplekser,
som er baggrund for fænotypiske forskelle i f.eks.
sygdomsresistensen og støtte identifikation af kandidatgener i de 5 ovennævnte QTL-områder.
Eksperimentel
infektion af svin med Ap
For at karakterisere grisens umiddelbare respons på infektion nærmere,
blev grise eksperimentelt inficeret med Ap serotype 5. Infektionen samt prøve-udtagning og behandling
blev foretaget af Danmarks Fødevare og Veterinær Forskning (DFVF-kontakt:
Peter Heegaard, pmhh@dfvf.dk). De inficerede grise
blev slagtet og obduceret efter 24 timer og udviste alle typiske lungelæsioner.
Der blev udtaget prøver af sygt og raskt lunge-væv fra de inficerede dyr samt lunge lymfe knuder og lever-væv fra inficerede samt ikke-inficerede kontrol dyr. Ekspressionsprofilerne af det
udtagne væv blev undersøgt ved hjælp af cDNA microarrays. Normalisering og statistisk analyse viste at
100 - 700 gener var signifikant differentielt udtrykt mellem inficeret/raskt
væv afhængig af vævstype. En umiddelbar gennemgang af resultaterne viste, som
forventet, at ekspressionen af gener med relation til immune-responset var påvirket. Således var gener kodende for interleukiner, chemokiner og forkellige komponenter af komplement systemet opreguleret i inficeret lunge-væv mens adskillige akut fase proteiner var opreguleret i lever-væv fra inficerede dyr. En test for overrepræsentation af specifikke Gene Ontology (GO)-termer indenfor ”Biological Process” (www.geneontology.org) blandt opregulerede
gener fra lever-væv, viste at grupper af gener
relateret til immune responset som f.eks. “response to stimulus”, “response to stress”, “response to biotic stimulus”, “defense response”,
“immune response”, “response to wounding” og “acute phase response” var signifikant
overrepræsenterede. Videre analyse af de opnåede resultater kan potentielt føre
til ny viden om grisens immune respons og yderligere bidrage til identifikation
af de gener, hvori genetisk variation har en betydning for dyrenes resistens..
Sekventering af Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 6 og 2
Med henblik på at opnå en detaljeret forståelse af patogenet Ap og dets interaktion med værtscellerne, herunder
forskellene mellem de forskellige serotypers virulens, har vi sekventeret genomerne for Ap serotype 2 og 6. Selvom størrelsen af Ap-genomet er på ca. 2,3 millioner basepar, så var det muligt at
gennemføre selve sekventeringen på ca. 14 dage per
genom ved hjælp af en ny sekventeringsteknologi baseret på hyper-parallel pyrosekventering (Genome Sequencer GS-20 fra Roche Life Sciences) der
som det første sted i Skandinavien er blevet etableret ved Sektion for
Molekylær Genetik og Systembiologi ved DJF. GS-20 muliggør parallel sekventering af op til 300.000 sekvenser på omkring. 100 basepar hver i løbet af et par dage, i alt ca. 30 mill. basepar. Komplet sekventering (20X) af Ap-genomet var således muligt ved bare to kørsler på instrumentet. Denne nye teknologi (se
figur 3) betyder en 10-100X forøgelse af sekventeringskapaciteten ved DJF og åbner op for en lang række nye muligheder inden for genomsekventering, resekventering og SAGE-baseret transkriptionsanalyse.
 |
Figur 3. Hyperparallel pyrosekventering med Genome Sequencer 20 (Margulies et al 2005). Sekventeringsprocessen med GS-20 består i princippet af 4 trin: forberedelse af et enkeltstrenget DNA
bibliotek, efterfulgt af en klonal amplifikation af de individuelle fragmenter (single molecule PCR) ved hjælp af emulsion-PCR.
Derefter sekventeres de enkelte fragmenter på beads i nano-wells ved hjælp af pyrosekventering (sequencing by synthesis). Signalet fra pyrosekventeringen i hver nano-well registreres af et højopløseligheds CCD kamera. Klik her for en større gengivelse. |
Der forestår nu et stort arbejde med annoteringen af genomerne fra Ap-2
og Ap-6 serotyperne med henblik på, at forstå
forskellene i deres interaktion med værtscellen, at forbedre den molekylære
forståelse af patogenets biologi og diagnostik, samt
at skabe mulighed for etablering af patogen-specifikke mikroarrays og lignende forskningsressourcer.
Litteratur:
Hornshoj, H., Stengaard, H., Panitz,
F., Bendixen, C., 2004. SEPON, a Selection and Evaluation Pipeline
for OligoNucleotides based on ESTs with a non-target T-m algorithm for reducing cross-hybridization in microarray gene expression experiments. Bioinformatics. 20, 428-429.
Jorgensen,
F.G., Hobolth, A., Hornshoj,
H., Bendixen, C., Fredholm,
M., Schierup, M.H., 2005. Comparative analysis of
protein coding sequences from human, mouse and the domesticated pig. Bmc Biology. 3.
Rouillard, J.M., Zuker, M., Gulari,
E., 2003. OligoArray 2.0: design of oligonucleotide probes for DNA microarrays using a thermodynamic
approach. Nucleic Acids Research. 31, 3057-3062.
Taylor, D. J. 1999,
”Actinobacillus pleuropneumoniae,”
in Diseases of swine, 8th ed edn, B. E. Straw et al.,
eds., Iowa State University Press, Ames, Iowa.
Wernersson, R., Schierup,
M.H., Jorgensen, F.G., Gorodkin, J., Panitz, F., Staerfeldt, H.H.,
Christensen, O.F., Mailund, T., Hornshoj,
H., Klein, A., Wang, J., Liu, B., Hu, S.N., Dong, W.,
Li, W., Wong, G.K.S., Yu, J., Wang, J., Bendixen, C., Fredholm, M., Brunak, S.,
Yang, H.M., Bolund, L., 2005. Pigs in sequence space:
A 0.66X coverage pig genome survey based on shotgun sequencing. BMC Genomics. 6.
|
