Da fødslen af det klonede lam, Dolly, rapporteredes i foråret
1997 (Wilmut et al., 1997) blev et af udviklingsbiologiens dogmer
aflivet: At differentierede celler ikke kan de-differentieres igen.
Det står på nuværende tidspunkt klart, at fænomenet kloning er så
komplekst, at vi med vor øjeblikkelige indsigt og forskning kun
kradser lidt i lakken. Et faktum, som volder stor bekymring, er,
at kun få procent af de tilvirkede klonede embryoner er i stand
til at udvikle sig til levendefødt afkom.
Der er gennem de seneste år fremkommet nye forskningsresultater,
som peger lidt i retningen af, hvad der sker, når arvemassen (genomet)
i en kropscelle re-programmeres og re-differentieres ved kloning.
Denne viden kan dels være af stor betydning for mulighederne for
at forbedre kloningsteknikken, men den kan også få skelsættende
betydning for udviklingen af terapi baseret på stamceller. I bund
og grund åbner den genomiske re-programmering muligheden for at
omdanne én celletype til en anden og hermed fremstille terapeutiske
cellepopulationer ved såkaldt transdifferentiering. Det er sigtet
med denne artikel at sammenfatte de væsentligste cellebiologiske
og molekylære forhold ved kloning samt at trække de mest markante
videnskabelige og samfundsmæssige perspektiver heraf op.
Tekniske aspekter af kloning ved kernetransplantation
Kernetransplantationens omdrejningspunkt er den ubefrugtede ægcelles
(oocytens) særlige egenskaber til re-programmering af genomet i
andre celler. I forbindelse med befrugtningen re-programmerer oocyten
således både sit eget genom samt det, som den modtager fra sædcellen,
til den sekventielle genekspression, som styrer embryonal- og fosterudviklingen.
Oocyten har imidlertid også vist sig i stand til at re-programmere
andre cellers, f.eks. kropscellers, genom. Kloning ved kernetransplantation
benytter sig af netop dette forhold. Populært sagt resulterer re-programmeringen
af kropscellens genom i, at det kernetransplanterede embryo udvikler
sig, som om det var ”befrugtet” med den ilagte cellekerne i stedet
for med en sædcelle.
 |
| Figur 1. Kloning ved kernetransplantation. Øverst tømmes en
kvægoocyt ved et mikrokirurgisk indgreb under mikroskop for
arvemassen (genomet), hvorved en cytoplast er dannet. Cytoplasten
føres sammen med den kernedonor (karyoplast), som ønskes klonet.
Karyoplasten kan komme fra et tidligt embryo (A), fra en cellekultur
af celler fra et embryo (B), fra en cellekultur af somatiske
celler fra et foster (C) eller fra en cellekultur af somatiske
celler fra f.eks. yveret af et voksent dyr (D). Cytoplast og
karyoplast elektrofusioneres, og det rekonstruerede embryo begynder
sin udvikling. |
I de tidligste forsøg benyttedes celler fra tidlige embryoner til
kernetransplantation (Willadsen et al., 1986). Teknikken bestod
i, at den modne oocyt blev frataget sit genom ved et mikrokirurgisk
indgreb. Resten af oocyten, den såkaldte cytoplast, fusioneredes
derefter med kernedonorcellen, den såkaldte karyoplast (Fig. 1A).
Fusionen udløstes af et elektrisk stød, som påvirkede cellemembranerne.
Herved opstod et såkaldt rekonstrueret embryo, som påbegyndte en
fornyet udvikling. Senere lykkedes det at klone får ved kernetransplantation
fra cellelinier, som var etableret fra blastocyster (Campbell et
al., 1996; Fig. 1B), og til slut lykkedes det at anvende cellelinier,
som var etableret fra kropsceller (somatiske celler) fra enten fostre
eller voksne individer; i Dollys tilfælde fra yveret (Wilmut et
al., 1997; Fig. 1C, D).
Resultaterne af kloning fra somatiske celler
På trods af at det i løbet af få år lykkedes at klone får(Wilmut
et al., 1997), kvæg (Cibelli et al., 1998), geder (Baguisi et al.,
1999), mus (Wakayama et al., 1998), svin (Poleajeva et al., 2000),
kanin (Chesne et al., 2002) og kat (Shin et al., 2002) ved kernetransplantation
fra somatiske celler fra voksne individer, stod det hurtigt klart,
at medaljen havde en bagside. Kloning ved kernetransplantation fra
somatiske celler var og er forbundet med en markant reduceret evne
til embryonaludvikling, forøget abortfrekvens gennem hele drægtighedsforløbet
samt med fødsel af afkom, som enten er for stort, har forskellige
alvorlige patologiske forandringer eller nedsat levedygtighed (sammenfattet
i syndromet ”large offspring syndrom”, Heyman et al., 2002). De
seneste par års undersøgelser har vist, at patologisk udvikling
af moderkagen (placenta) er en hovedårsag til disse problemer (Hill
et al., 2000; De Sousa et al., 2001; Heyman et al., 2002).
Molekylære aspekter af den genomiske reprogrammering
Det står på nuværende tidspunkt klart, at den genomiske re-programmering,
som finder sted i cytoplasten, ofte er forbundet med afvigende genekspression.
De molekylære mekanismer, som ligger til grund herfor, synes at
hænge direkte sammen med epigenetiske forhold under re-programmeringen
af genomet. Methylering af DNA-nukleotidet cytosin er dybt involveret
i reguleringen af genekspression, således at højt methylerede områder
af DNA ikke eksprimeres (for udmærket dansk oversigt se Fenger og
Vaag, 1999). Nyere undersøgelser har vist, at både det maternelle
og det paternelle genom demethyleres kraftigt umiddelbart efter
befrugtningen for siden at re-methyleres (Mann og Bartolomei, 2002).
Dette tillader, at netop den særlige genekspression, som danner
baggrund for embryonal- og fosterudviklingen, fremmes. Det er ligeledes
vist, at embryoner klonet ved kernetransplantation fra somatiske
celler ikke udviser samme grad af de-methylering, som normalt befrugtede
embryoner. Dette betyder, at den genekspression, som er nødvendig
for normal udvikling af i særdeleshed placenta, ikke forløber normalt.
De såkaldt imprintede gener, hvor kun den paternelle eller maternelle
allel eksprimeres under embryonaludviklingen, udgør formentligt
et særligt problem i denne forbindelse (Young et al., 2001). De
imprintede geners ekspression styres ligeledes i vid udstrækning
af methylering, som etableres i gameterne efter et kønsspecifikt
mønster. Denne imprinting mistes som oftest i løbet af embryonal-
og fosterudviklingen, og findes derfor ikke i somatiske celler.Ved
kloning fra somatiske celler grundlægges udviklingen således fra
et genom, som ikke er imprintet, og det må formodes, at cytoplasten
kun i ringe udstrækning er i stand til at etablere det kønsspecifikke
imprint, som er nødvendigt for den rette genekspression.
Perspektiver af kloning fra somatiske celler
Det som er med til at gøre kloning fra somatiske celler så fascinerende
er, at det på den ene side er forbundet med en særdeles kompliceret
biologi, som umiddelbart sætter en rækker grænser for hvor langt
træerne vokser ind i himmelen, og på den anden side rummer uanede
perspektiver, som meget vel kan revolutionere de fleste afkroge
af den medicinske verden. Når fænomenet kloning skal perspektiveres
skelnes oftest mellem reproduktiv kloning og terapeutisk kloning.
Ved reproduktiv kloning resulterer processen i fødslen af afkom
efter overførsel af de rekonstruerede embryoner til rugemødre. Ved
terapeutisk kloning resulterer processen i tilvirkning af rekonstruerede
embryoner, som dyrkes in vitro i en til to uger, hvorefter der kan
høstes stamceller til medicinsk brug fra dem. I sidste instans kan
den terapeutiske kloning åbne muligheder for transdifferentiering
som nævnt i indledningen Den terapeutiske kloning resulterer således
ikke i drægtigheder og klonede individer.
Reproduktiv kloning
Brugen af reproduktiv kloning i forbindelse med husdyravl har været
diskuteret meget. I bund og grund understøtter kloningens biologi
kun avlsarbejdet dårligt. Konventionel avl er baseret på, at kombination
af egenskaberne fra overlegne avlsdyr fra én generation skaber yderligere
genetisk fremgang til næste generation. Ved kloning føres samme
genom uden forbedringer videre til næste generation. Det er muligt,
at kloning fra somatiske celler kan finde begrænset strategisk anvendelse
i avlsarbejdet, men nogen større udbredelse af kloning i denne sammenhæng
kan ikke forventes.
Den reproduktive kloning har derimod vist sig overlegen i forbindelse
med produktion af gensplejsede (transgene) husdyr. Kloningsprocessen
er baseret på brugen af dyrkede karyoplaster, og muligheden for
genetisk manipulation af cellerne før de anvendes til rekonstruktion
af embryoner er nærliggende. Det har da også vist sig muligt at
producerede transgene husdyr med langt større sikkerhed ved kloning.
Tidligere baserede tilvirkning af transgene husdyr sig på injektion
af de transgene DNA konstruktioner i zygotens forkerner, hvor de
i heldigste fald integreres på tilfældige positioner i genomet.
Herefter blev embryonerne dyrket og de overlevende overført til
rugemødre. Denne metode resulterer hos mus i, at omkring en fjerdedel
af de fødte unger er transgene. Hos de større husdyr ligger effektiviteten
imidlertid helt nede på én procent eller derunder på grund af manglende
integration af det injicerede transgen eller manglende ekspression
deraf. Tilvirkes transgene dyr derimod ved kloning, overføres transgenet
til de dyrkede karyoplaster ved transfektion, og da genet som oftest
er knyttet til et markørgen, kan de celler, som det er lykkedes
at gøre transgene, udvælges og anvendes som karyoplaster. Sidst
men ikke mindst er det lykkedes at indsætte nye gener på specifikke
lokaliteter i cellernes genom (”gene-targeting”) forud for kernetransplantation
(McCreath et al., 2000). Dette betyder yderligere kontrol over genernes
funktion samt tillader knockout af gener (se senere).
Transgene husdyr har en vifte af applikationer, som i første omgang
mest har manifesteret sig på det biomedicinske område. Der findes
på nuværende tidspunkt en lang række eksempler på transgene får,
kvæg, geder og svin, som udskiller forskellige menneskelige proteiner
med mælken. Der er ingen tvivl om, at denne form for ”biofarming”
i fremtiden vil være i stand til at levere livsvigtig medicin til
behandling af en række menneskelige sygdomme. Denne kombinerede
anvendelse af kloning ved kernetransplantation og transgene teknikker
er ikke stødt på så store etiske hindringer som andre mulige anvendelser
af transgene dyr.
En anden biomedicinsk applikationsmulighed, som har været genstand
for stor omtale, er fremstillingen af transgene svin som organdonorer
til xenotransplantation til mennesker. Der er endnu en række forhindringer,
der skal overvindes, før brugen af svineorganer til transplantation
kan realiseres. Den hyperakutte afvisning af transplanterede organer
skyldes aktiveringen af det såkaldte komplementsystem, som ikke
kan forebygges gennem administration af immunsuppressive lægemidler.
Der er to strategier til at forebygge komplementsystemets hyperakutte
afvisning af svineorganer: For det første kan indsættes humane proteiner
på svinecellernes overflader, som gør dem ”menneskelige”, og for
det andet kan særlig aggressive svineepitoper på celleoverfladen
fjernes. Der er udført en række forsøg, hvor den første strategi
er lykkedes i nogen udstrækning. Der er specielt fokuseret på de
såkaldte ”clusters of differentiation” (CD). Således er CD55 (eller
Decay Accellerating Factor, DAF), CD46 (Membrane Cofactor Protein,
MCP) og CD59 velkendte regulatorer af komplementsystemet. Der er
tilvirket svin, som er transgene for henholdsvis DAF og CD59, og
primater, som fik hjerter fra disse svin transplanteret, kunne overleve
i flere måneder. Til sammenligning afstødtes hjerter fra ikke-transgene
svin transplanteret til primater hyperakut i løbet af få minutter.
Med hensyn til den anden strategi, at fjerne særlig aggressive
epitoper på svinecellerne, er der særlig fokus på de såkaldte 1,3-b-gal-epitoper.
Disse udløser ligeledes den akutte afstødning af svineorganer. For
at fjerne disse epitoper skal imidlertid foretages knock-out af
det gen, som er ansvarlig for etableringen af epitoperne på plasmamembranen,
nemlig genet for enzymet galactosyltranferase. Det har længe været
muligt at tilvirke knockout-mus. Det lykkedes imidlertid først i
slutningen af 2002 producere svin, hvor galactosyltransferase genet
er knockout’et (Lai et al., 2002).
Endelig skal det nævnes, at der har været en del bekymring for
at retrovirussekvenser, som findes i svinegenomet, kan overføres
fra et transplanteret svineorgan til menneskeceller og hermed transformeres
i patogen retning. Denne risiko er svær at vurdere, og fra amerikansk
side hævdes det, at der nu er fremavlet svin, fra hvilke virussekvenser
ikke kan spredes. Alt i alt har perspektiverne om xenotransplantation
af svineorganer været genstand for betydeligt alvorligere etiske
bekymringer, end hvad angår de medicinproducerende transgene dyr.
Det er således usikkert, om transplantation af svineorganer har
nogen fremtid for sig. Måske kunne man forestille sig kortere tids
brug af organer som f.eks. levere perfunderet udenfor kroppen til
at opretholde livsfunktioner i en kritisk periode. En sidste mulig
biomedicinsk applikation af transgene husdyr er tilvirkning af sygdomsmodeller,
som tillader studier af menneskelige sygdomme.
Til slut skal muligheden for anvendelse af transgene husdyr i den
agroindustrielle produktion blot nævnes. De transgene teknikker
tillader modifikationer af f.eks. mælkesammensætning og kødfylde,
men der er ikke nogen tvivl om, at den slags produkter på nuværende
tidspunkt ikke vil blive accepteret af mange forbrugere.
Terapeutisk kloning
Mange sygdomme som f.eks. Parkinson’s, Alzheimer’s, diabetes, kroniske
ledlidelser, leverbetændelse og blodpropper skyldes eller forårsager
irreversibelt tab af celler. Den terapeutiske kloning tager sigte
på fremstilling af celler, som kan anvendes som reservedele til
mennesker. Den grundlæggende tanke er, at der fra en given patient
kan udtages somatiske celler, som kan anvendes til kloning ved kernetransplantation
(figur 2). De rekonstruerede embryoner dyrkes herefter én til to
uger, hvorefter det er mulig at høste pluripotente stamceller fra
dem. Disse stamceller rummer muligheden for differentiering til
alle kroppens celletyper. De differentierede celler kan siden føres
tilbage til patienten, med hvem de er fuldt forenelige, da transplantationen
er autolog, til erstatning af defekte celler.
 |
| Figur 2. Skematisk fremstilling af princippet i terapeutisk
kloning. Celler udtages fra en patient og etableres i cellekultur,
hvorfra karyoplaster til kloning ved kernetransplantation udtages.
Fra det rekonstruerede embryo kan efter én til to ugers udvikling
høstes pluripotente stamceller, som siden kan differentieres
til ønskede reserveceller, som kan transplanteres tilbage til
patienten. |
For nylig er en sådan behandling lykkedes hos immundeficiente mus
(Rideout et al., 2002): Der etableredes celleliner fra de immundeficiente
mus, klonede embryoner re-konstrueredes fra disse celler, stamceller
isoleredes fra de klonede embryoner og mutationen korrigeredes i
disse stamceller, og endelig blev de korrigerede stamceller efter
differentiering in vitro transplanteret til de immundeficiente mus
med det resultat, at de delvist genvandt deres immunfunktion.
Det er indlysende, at disse perspektiver støder mod en række barrierer
af både biologisk og etisk karakter. På det biologiske niveau er
hele embryorekonstruktionen selvfølgelig underlagt samme usikkerhedsmomenter,
som allerede beskrevet. Dette betyder også, at det grundlæggende
set er usikkert, hvorvidt de stamceller, som produceres, er epigenetisk
normale, hvilket igen kan rejse tvivl om deres videre opførsel som
differentierede celler.
Et andet problem ligger i tilvejebringelse af humane oocyter til
cytoplastproduktion. På grund af kloningsteknikkens lave effektivitet
vil der være behov for store mængder donerede oocyter for blot at
fremstille en enkelt pluripotent stamcellelinie. Som alternativ
kan overvejes brugen af artsfremmede cytoplaster fra f.eks. kvæg
eller svin, hvilket imidlertid vil tilføre yderligere ukendte faktorer.
Således vil de tilvirkede stamcellers genom være humant, mens hovedparten
af cytoplasma inkluderende mitochrondiernes genom vil være af artsfremmed
oprindelse. Hvad dette betyder for de resulterende celler, er uforudsigeligt
på nuværende tidspunkt.
Endelig knytter der sig en række problemstillinger til håndteringen
af de stamceller, som kan høstes fra de rekonstruerede embryoner.
Den første udfordring er at stimulere de pluripotente celler til
at differentiere sig til ønskede celletyper. Det synes på nuværende
tidspunkt indenfor rækkevidde at producere en række forskellige
celletyper som f.eks. neuroner og insulinproducerende b-celler.
Den næste udfordring er at styre disse cellers opførsel, når de
transplanteres til den menneskelige organisme. Der kræves stadig
megen forskning før det lader sig gøre at styre de transplanterede
cellers lokalisering og udbredelse. Endvidere er der fremført bekymringer
om hvorvidt onkogener, som kan transformere de transplanterede celler
til tumorceller, vil kunne aktiveres.
Det kan ikke forbavse, at der på baggrund af ovennævnte biologiske
usikkerheder, er stor etisk bekymring over den terapeutiske kloning.
Det faktum at processen som beskrevet endvidere er forbundet med
tilvirkning af et klonede humane embryoner, som ganske vist ikke
når at udvikle sig videre end én til to uger, giver anledning til
særlig bekymring, idet det betragtes som en glidebane mod reproduktiv
kloning af mennesker.
Afslutningsvis skal det anføres, at kloningsbiologien på længere
sigt åbner muligheder for at forstå de mekanismer, som regulerer
cellers differentiering. Der findes i cytoplasten faktorer, som
er i stand til at de-differentiere celler. Kan disse beskrives og
styres, kan det måske på sigt blive muligt at de-differentiere og
siden re-differentiere celler uden brug af cytoplaster ved såkaldt
transdifferentiering.. De første skridt i retning af transdifferentiering
er taget, idet det er vist, at celler inkuberet under særlige forhold
med ekstrakter, udvundet fra andre celletyper, tager genekspressionsmæssigt
præg af den celletype, hvorfra ekstraktet er udvundet (Håkelien
& Collas, 2002). Dette forskningsfelt er særdeles lovende og
vil i de kommende år blive genstand for intens aktivitet for at
fremme mulighederne for autolog transplantation af terapeutisk vigtige
celler.
Afslutning
Forskning i kloning rummer mange perspektiver indenfor såvel husdyrbrug
som humanmedicin. I særdeleshed rummer kloningens grundlæggende
biologi en mulig nøgle til at omdanne celler fra én type til en
anden ved transdifferentiering. Dette fænomen er af største betydning
for muligheden for at tilvirke terapeutiske cellepopulationer til
autolog transplantation.
Referencer
Baguisi A, Behboodi E, Melican DT, Pollock JS, Destrempes MM, Cammuso
C, Williams JL, Nims SD, Porter CA, Midura P, Palacios MJ, Ayres
SL, Denniston RS, Hayes ML, Ziomek CA, Meade HM, Godke RA, Gavin
WG, Overstrom EW, Echelard Y. Production of goats by somatic cell
nuclear transfer. Nat Biotechnol 1999; 17: 456-61.
Campbell KHS, McWhir J, Ritchie WA, Wilmut I. Sheep cloned by nuclear
transfer from a cultured cell line. Nature 1996; 380: 64-6.
Chesne P, Adenot PG, Viglietta C, Baratte M, Boulanger L, Renard
JP. Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic
cells. Nat Biotechnol 2002; 20: 366-9.
Cibelli JB, JB, Stice SL, Gloueke PJ, Kane JJ, Jerry J, Blackwell
C, Ponce de Leon FA, Robl JM. Transgenic bovine chimeric offspring
produced from somatic cell-derived stem-like cells. Nat Biotechnol
1998; 16: 642-6.
De Sousa PA, King T, Harkness L, Young LE, Walker SK, Wilmut I.
Evaluation of gestational deficiencies in cloned sheep fetuses and
placentae. Biol Reprod 2001; 65: 23-30.
Fenger M, Vaag AA. Epigenetik: DNA-metylering. Videnskab og Praksis
1999; 3823-7.
Heyman Y, Chavatte-Palmer P, DeBourhis D, Camous S, Vignon X, Renard
JP. Frequency and occurrence of late-gestation losses from cattle
cloned embryos. Biol Reprod 2002; 66: 6-13.
Hill JR, Burghard RC, Jones K, Long C, Looney C, Shin T, Spencer
T, Thompson J, Winger Q, Westhusin ME. Evidence for placental abnormality
as a major cause of mortality in first-trimester somatic cell cloned
bovine fetuses. Biol Reprod 2000; 63: 1787-94.
Håkelien A-M, Collas P. Novel approaches to transdifferentiation.
Cloning and Stem Cells 2002; 4:379-387.
Lai L, Kolber-Simonds D, Park KW, Cheong HT, Greenstein JL, Im
GS, Samuel M, Bonk A, Rieke A, Day BN, Murphy CN, Carter DB, Hawley
RJ, Prather RS. Production of alpha-1,3-galactosyltransferase knockout
pigs by nuclear transfer cloning. Science 2002; 295: 1089-92.
Mann M, Bartolomei MS. Epigenetic reprogramming in the mammalian
embryo: struggle of the clones. Genome Biol 2002; 3: 1003.1-4.
McCreath KJ, Howcroft J, Campbell KHS, Colman A, Schnieke AE, Kind
AJ. Production of gene-targeted sheep by nuclear transfer from cultured
somatic cells. Nature 2000; 405: 1066-9.
Poleajeva IA, Chen SH, Vaught TD, Page RL, Mullins J, Ball S, Dai
Y, Boone J, Walker S, Ayares DL, Colman A, Campbell KH. Cloned pigs
produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature 2000;
407: 86-90.
Rideout WM 3rd, Hoechedlinger K, Kyba M, Daley GQ, Jaenisch
R. Correction of a genetic defect by nuclear transplantation and
combined cell and gene therapy. Cell 2002; 109: 17-27.
Shin T, Kraemer D, Pryor J, Liu L, Rugila J, Howe L, Buck S, Murphy
K, Lyons L, Westhusin M. A cat cloned by nuclear transplantation.
Nature 2002; 415: 859.
Young LE, Fernandes K, McEvoy TG, Butterwith SC, Gutierrez CG,
Carolan C, Broadbent PJ, Robinson JJ, Wilmut I, Sinclair KD. Epienetic
change in IGF2R is associated with fetal overgrowth after sheep
embryo culture. Nature Gen 2001; 27: 153-4.
Wakayama T, Perry AC, Zuccotti M, Johnson KR, Yanagimachi R. Full-term
development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus
cell nuclei. Nature 1998; 394: 369-74.
Willadsen SM. Nuclear transplantation in sheep embryos. Nature
1986; 320: 63-5.
Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KH. Viable offspring
derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 1997; 385:
810-3.
|
