Siden sidst dækker denne gang perioden fra ca. 1. juli til 1.
oktober. Det har været en ganske frugtbar høst med otte high-profile
artikler. Vi har imidlertid ændret formatet af Siden sidst en smule,
så der nu kun bliver 1-2 direkte omtaler, mens resten af artiklerne
bliver givet i en liste bagest i indslaget. Denne gang står den
således på RNA reguleret genekspression i E. coli samt Siden sidst-debut
til biofysikken med et proteinfoldningsarbejde.
Antisense-regulering af translationsinitiering i E. coli.
Spot 42 RNA mediates discoordinate expression of the E.
coli galactose operon.
Genes & Development 16 (2002): 1696-1706.
T Møller, T Franch, C Udesen, K Gerdes, P Valentin-Hansen.
Syddansk Universitet, Odense.
Med identifikationen af små dobbeltstrengede RNA molekyler (siRNA)
som nøglekomponenter i RNA interferens/Post-Transcriptional Gene
Silencing samt isoleringen af et stort antal endogene mikro RNA
species (miRNA) med afgørende roller i specielt vævsdifferentiation,
er RNA-medieret regulering af genekspression i løbet af ganske kort
tid blevet et af molekylærbiologiens hotteste felter. Mens mi/siRNA
kontrolapparatet ikke er til stede i prokaryoter, lader det dog
til at princippet om styring af genekspression ved næsten-komplementære
RNA molekyler også er at finde her. Dette arbejde giver en særdeles
nydelig karakterisering af en sådan antisense kontrolmekanisme i
E. coli.
Forfatternes system er den velstuderede galETKM operon
i E. coli, og RNA molekylet under studium er det såkaldte Spot 42
RNA (Spf). Gal operonen koder for gener involveret i galaktosemetabolisme
[GalK: Galaktose kinase; GalT: UDP transferase; GalE: UDP-Glc/UDP-Gal
epimerase; GalM: Glc-1-P mutase], og tidligere studier har vist,
at de forskellige Gal proteiner translateres fra den polycistroniske
Gal messenger med forskellig effektivitet alt efter metaboliske
omstændigheder. Med galaktose som kulstofkilde er GalK:GalE forholdet
således 4 gange højere end under glukose-vækst pga fald i GalK produktion
fra gal messengere. Denne diskoordinerede ekspression involverer
den globale transkriptionsregulator CRP (cAMP receptor protein),
der i kompleks med ”glukose-sult signalet” cAMP aktiverer transkription
fra bl.a. operons involveret i metabolisme af alternative sukre
(fx fra lac- og en af de to alternative gal-promotorer).
Adenylat cyclase mutanter har således diskoordineret Gal ekspression,
der lige så vel som glukose-induceret diskoordineret ekspression
kan hæmmes ved tilsætning af cAMP. Samtidig vides ekspression af
Spot 42 RNA at være negativt reguleret af cAMP-CRP komplekset, og
da forfatterne noterer sig, at der er klare komplementære regioner
mellem Spot 42 RNA og området omkring GalK translationsstart i gal
messengeren, kommer de på den idé, at diskoordineret Gal ekspression
kunne medieres af Spot 42 RNA ved antisense kontrol.
Første test af denne hypotese er at kigge på effekten af inducibel
Spot 42-ekspression og Spot 42 knockout på Gal protein ekspression.
Med pulse-chase 35S-Met mærkning ses, at syntesehastigheden
af GalK protein specifikt nedsættes under Spot 42 induktion, og
GalE, T, K westerns viser, at glukoseinduceret diskoordineret Gal
ekspression hæmmes helt af Spot 42 knockout. En klar rolle af Spot
42 RNA i medieringen af diskoordineret Gal ekspression er således
etableret, så forfatterne skynder sig videre til at teste den foreslåede
antisense mekanisme.
Her går de grundigt til værks og bruger først software til at foreslå
en mulig sekundær struktur af Spot 42 RNA molekylet og gør sig endda
den anstrengelse at vise, at de væsentlige aspekter af deres model
(placeringen af stem/loop regioner) er i god overensstemmelse med
RNase probing eksperimenter. Sammenligning med Spot 42 homologer
fra andre bakterier viser desuden størst tæthed af nukleotidændringer
i enkeltstrengede områder og basepar kompenserende ændringer i dobbelstrengede
områder. En særlig dejlig egenskab ved deres sekundære struktur
er, at store dele af den galK komplementære sekvens ser ud
til at ligge i tilgængelige områder af Spot 42 RNAet.
Med et gal mRNA fragment, der omfatter galK translationsinitieringsområdet
bruges nu gel skift forsøg til at vise, at de to RNA molekyler rent
faktisk kan binde specifikt til hinanden, og med et nydeligt RNase
T2 (specifik for enkeltstrenget RNA) footprint ses, at
tre korte områder i den enkeltstrengede, galK komplementære
region af Spot 42 beskyttes under binding til galK mRNA fragmentet.
Hypotesen holder altså indtil videre: Den regulatoriske korrelation
mellem Spot 42 og GalK er OK in vivo, og in vitro ses binding, der
meget vel kunne tænkes at hæmme ribosombinding til gal messengeren.
For helt at hamre hovedet på sømmet bruges et såkaldt toe-printing
assay til at vise, at Spot 42-galK interaktionen rent faktisk
forhindrer binding af galK til den lille ribosomale subunit.
Her udnyttes at når 30S sidder bundet til mRNAet fås et stærkt stop
signal i en primer extension reaktion startet nedstrøms for start
kodon. Med en galT messenger ses det klare stop signal selv
i tilstedeværelse af Spot 42 RNA, mens Spot 42 RNA i overskud helt
fjerner stop signalet – og derfor 30S binding – i galK reaktionen.
En interessant krølle på historien er at Odense-gruppen tidligere
har vist, at det Sm-lignende protein Hfq er nødvendigt for Spot
42 funktion; sandsynligvis som mediator af RNA:RNA interaktioner
(Møller et al. 2002, Mol. Cell 9:23-30; se iø Siden sidst i Biozoom
nr. 2, 2002). Eukaryote Sm lignende proteiner er involveret i mRNA
metabolisme (fx decapping), men mutanter i biokemisk ukarakteriserede
Sm homologer, hvis fænotyper tyder på specifikke regulatoriske funktioner,
antyder at en skelen til E. coli Hfq:Spot 42:galK modellen
for inspiration kunne være nyttig også i eukaryote systemer.
2-state or not 2-state
Early kinetic intermediate in the folding of acyl-CoA binding
protein detected by fluorescence labeling and ultrarapid mixing
PNAS 99 (2002): 9807-9812
K Teilum, K Maki, BB Kragelund, FM Poulsen, H Roder. Københavns
Universitet; University of Philadelphia.
Igennem mange årtier har mekanismerne for hvorledes proteiner folder,
dvs. hvordan et protein finder sin native struktur fra en udfoldet
tilstand, forundret forskere. En af de dominerende ideer kom tidligt
fra Levinthal, der i en grov beregning anslog hvor mange konformationer
et protein med et givent antal rester kunne antage. Dette tal, der
viser sig at være astronomisk, brugte han som argument for at der
måtte være specifikke foldningsveje (pathways), da en tilfældig
søgning i dette enorme konformationsrum umuligt kunne være kompatibelt
med de observerede foldningshastigeder, ja rent faktisk ville proteiner
ikke kunne folde i universets levealder. Dette argument, som sidenhen
viste sig ikke at være gyldigt da foldning ikke er en tilfældig
proces, blev et startskud til en række undersøgelser af proteiners
foldningsveje. I særdeleshed ville man undersøge de intermediater
og hastighedsbegrænsende »transition states« som et protein måtte
gennemgå for at komme fra den udfoldede tilstand til den native
struktur. Der blev i særdeleshed fokuseret på intermediater, dels
fordi de er nemmere at studere en transition states (intermediater
er lokale minima i energi langs foldningsvejen, transition states
er maxima), dels fordi Levinthal argumenterede for at det var gennem
disse intermediater at et protein undgik at fare vild i det enorme
konformationsrum. Det var derfor en overraskelse at der tidligt
i 90’erne blev fundet proteiner, hvoraf byg-proteinet CI2 var det
første, der tilsyneladende foldede uden detekterbare intermediater.
Denne slags proteiner, der kaldes 2-state da der kun befolkes to
tilstande, den udfoldede og den native men ingen intermediære, blev
sidenhen et paradigme for foldnigsstudier, da de er nemmere at studere
pga. deres simple foldnings kinetik.
Et af de bedst studerede 2-state proteiner er et acyl bindende
protein, ACBP, der har været studeret biofysisk med en lang række
af teknikker i Poulsens gruppe. Proteinet opfylder alle de gængse,
og ret strenge, kriterier for at have 2-state foldning. Det var
derfor overraskende at hydrogenudvekslingseksperimenter for nogle
år siden indikerede at der tidligt i foldingsprocessen blev dannet
partiel struktur. Denne observation er i uoverensstemmelse med den
traditionelle 2-state opførsel, der udsiger at der ikke befolkes
nogen partielt foldede, stabile strukturer mellem den udfoldede
og den foldede tilstand.
Et karakteristikum ved foldningen af disse små, 2-state proteiner
er at de ofte folder meget hurtigt. ACBP folder f.eks. med en tidskonstant
i størrelsesorden 5 ms for det hastighedsbegrænsede trin. Det er
derfor særdeles vanskeligt, rent teknisk, at studere processer der
foregår tidligt i foldningsvejen da disse ofte er meget hurtigere.
Dette er dog lykkedes i det netop publicerede arbejde i PNAS hvor
Teilum et al. viser at det er muligt at observere endnu en
kinetisk fase i ACBP foldningen, hvilket viser at der er mindst
tre stabile tilstande for ACBP; udover den udfoldede og den foldede
er der en intermediær tilstand der dannes tidligt i foldningsprocessen.
For at observere denne intermediære tilstand må Teilum et al.
dog ty til et par krumspring. Dels kræves der særligt udstyr for
at observere meget hurtige processer, dels kræves der en velegnet
spektroskopisk probe der kan adskille de forskellige tilstande.
For at overkomme første problem benyttes der en, i princippet meget
simpel men i praksis ganske kompliceret, teknik kaldet continuous
flow (CF). CF er en metode til hurtigt at blande to opløsninger
og dermed initiere foldningsprocessen. Med det benyttede apparat
kan man observere processer med tidskonstanter ned til omkring 50-100
ms. Hvis foldning af ACBP studeres med dette apparat er der indikation
for en hurtig proces tidligt i foldningsprocessen. For at kunne
studere denne proces i detalje kommer det andet trick, nemlig at
introducere en fluorescerence gruppe (IAEDANS) på en specifik position
i ACBP. IAEDANS har den egenskab at den kan indgå i fluorescens
resonans energi overførsel med de to tryptophan rester i ACBP. Denne
overførsel er stærkt afhængig af afstanden mellem Trp resterne og
IAEDANS gruppen, hvilket giver en særdeles følsom spektroskopisk
probe for konformationelle ændringer. Med kombinationen af CF teknikken
og IAEDANS opmærkningen opnår Teilum et al. præcise kinetiske
parametre for de kinetiske faser i ACBP foldningen. Ved at studere
effekten af denaturant på de kinetiske parametre udledes der at
det observerede intermediat dannes meget tidligt i foldningen; ikke
kun tidsmæssigt set men også ved at det tilsynelande er meget mere
ekspanderet end både den foldede form og den hastighedsbegrænsende
tilstand, der dannes lige inden den foldede form.
Med disse studier af ACBP har Teilum et al. føjet ny, vigtig
information til de processer der er involveret i ACBP foldningen.
Men derudover har studierne også bragt et nyt spørgsmål på banen:
hvad er kriterierne for at man kan sige at et protein folder med
2-state kinetik? Tilsynelande, udfra de gængse kriterier, folder
ACBP som et sådant. Først med to styk krumspring, CF og IAEDANS
mærkning, kan den hurtige fase observeres. Der åbnes derfor også
mulighed for at foldningen af andre proteiner, der hidtil er blevet
kategoriseret som 2-state, måske også involverer dannelsen af intermediater.
Måske er det simple 2-state billede en hypotetisk abstraktion, der
viser sig, hvis man leder godt nok, at være meget sjædent observeret.
Øvrige artikler
Analysis of the Plasmodium falciparum proteome by high-accuracy
mass spectrometry.
Nature 419 (2002): 537-542.
E Lasonder, Y Ishihama, JS Andersen, AMW Vermunt, A Paln, RW
Sauerwein, WMC Eling, N Hall, AP Waters,HG Stunnenberg, M Mann.
Syddansk Universitet, Odense; University of Nijmegen, NL; University
of Leiden, NL; Wellcome Trust Sanger Institute, UK.
A functional and structural basis for TCR cross-reactivity
in multiple sclerosis.
Nature Immunology 3 (2002): 940-943.
HLE Lang, H Jacobsen, S Ikemizu, C Andersson, K Harlos, L madsen,
P Hjorth, L Søndergaard, A Svejgaard, K Wucherpfennig, DI Stuart,
JI Bell, EY Jones, L Fugger.
Skejby Sygehus, Aarhus; Aarhus Universitet; Rigshospitalet,
København; Københavns Universitet; University of Oxford, UK; John
Radcliffe Hospital, UK; Dana-Farber Cancer Institute, USA.
A phosphoserine/threonine-binding pocket in AGC kinases
and PDK1 mediates activation by hydrophobic motif phosphorylation.
EMBO Journal 21 (2002): 5396-5407.
M Frödin, TL Antal, BA Dümmler, CJ Jensen, M Deak, S Gammeltoft,
RM Biondi. Glostrup Hospital; University of Dundee, UK.
Hereditary spastic paraplegia SPG13 is associated with
a mutation in the gene encoding mitochondrail chaperonin Hsp60.
American Journal of Human Genetics 70 (2002): 1328-1332.
JJ Hansen, A Dürr, I Cournau-Rebeix, C Georgopoulos, D Ang,
MN Nielsen, C-S Davoine, A Brice, B Fontaine, N Gregersen, P Bross.
Skejby Sygehus, Aarhus; Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière,
FR; Centre Medical Universitaire, Genève, Schweiz.
Molecular cloning and functional expression of the first
insect FMRFamide receptor.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002): 12073-12078.
G Cazzamali, CJP Grimmelikhuijzen. Københavns Universitet.
Delayed onset of brain edema and mislocalization of aquaporin-4
in dystrophin-null transgenic mice.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002): 13131-13136.
Z Vajda, M Pedersen, E-M Füchtbauer, K Wertz, H Stødkilde-Jørgensen,
E Sulyok, T Dóczi, JD Neely, P Agre, J Frøkiær, S Nielsen.
Aarhus Universitet; Skejby Sygehus, Aarhus; Max Planck Institute
of Immunolgy, Freiburg, DE; University of Pecs, Ungarn; Johns Hopkins
University, USA. |
