Vanillens historie
Vanilleorkidéen er oprindelig hjemmehørende i Sydøst Mexico, hvor
den voksede som det eneste kendte sted i verden. Vanille var et
eksklusivt og svært tilgængeligt krydderi, fordi man ikke kunne
få planten til at bære frugt andre steder. Efter Cortez’s erobring
af Aztekerne i 1519 blev vanille kendt i Europa, bragt hertil af
en spansk handelsrejsende. I starten af 1600-tallet introduceres
vanille i Frankrig, hvor den anvendes til at mildne smagen af kaffe
og tillige som indhold i chokoladedrikke.
I 1836 fandt man, at en bestemt bi, melipone bien, er ansvarlig
for bestøvning af vanilleorkidéen og få år efter udvikledes en teknik,
hvorved håndbestøvning blev mulig, således at vanilleorkidéen kunne
dyrkes udenfor Mexico, nemlig i Réunion og Madagasker. I 1900-tallet
bliver vanilleorkidéen dyrket adskillige steder og vanille bliver
og er stadig den mest populære aroma i verden. Den anvendes til
mad- og drikkevarer, konfekture, som duft i parfumer og kosmetik
og i farmaceutiske produkter. I dag produceres 60 procent af verdensmarkedets
vanille fra sorten Vanilla Planifolia på øerne Madagasker, Réunion
og Comorerne i det Indiske ocean, 30 procent leveres af Indonesien.
Desuden produceres vanille på Tahiti (Vanilla Tahitensis), Bali,
Guadeloupe (Vanilla pompona) og Martinique i Vestindien. Under 1
procent af verdensproduktionen stammer i dag fra Mexico.
Vækstbetingelser for vanilleorkidéen
Der kræves helt specielle vækstbetingelser for vanilleorkidéen:
Beliggenhed 10-20 grader nord eller syd for ækvator og 600 m over
havoverfladen, varmt og fugtigt tropisk klima med en årlig temperatur
på 24-30°C, næsten ingen vind og let skrånende rig jord. Vanilleorkidéen
blomstrer efter 3 års vækst og blomsterne bliver alle andre steder
end i Mexico håndbestøvet på et ganske bestemt tidspunkt. 6-9 måneder
efter bestøvning er bælgene gule i spidsen og klare til at blive
høstet for efterfølgende modning (Fig. 1). Sker høsten for tidligt,
opnås en forringet aroma kvalitet og udbytte og kommer høsten for
sent i gang, ødelægges bælgen, hvorved den kommercielle værdi forringes.
 |
| Figur 1. (A) Håndbestøvning af vanilleblomst. Vanillebælge
før (B) og efter (C) behandling. |
Behandling af bælge
Friske bælge har ikke dannet aromakomponenter og en behandling
er nødvendig for at udvikle disse. For at igangsætte processen nedsænkes
bælgene i varmt vand et par minutter for at ødelægge klorofyl, afslutte
modningsprocessen, bryde de indre vægge og udløse de enzymatiske
reaktioner. Selve fermenteringsprocessen foregår ved, at de varme
og tørrede bælge pakkes ind i tæpper et døgns tid. I denne periode
tabes fugtighed og bælgene får deres karakteristiske brune farve.
Den efterfølgende langsomme tørringsproces foregår ved, at bælgene
spredes på tæpper i solen om dagen og indendørs om natten for at
skabe så favorable temperaturer som muligt for enzymprocesserne.
Bælgene bliver herved mørkere, udvikler aromaer og skrumper. Endelig
tørres bælgene i flere måneder og efterfølgende vurderes bælgenes
kvalitet på bønnernes længde, udseende, farve og fugtighedsindhold.
Vanille ekstraktionsprocessen foregår med en blanding af ethanol
og vand efterfulgt af sedimentation, filtrering og centrifugering
og endelig flere måneders modning, hvor alkoholen i ekstraktet accelererer
dannelse af estere fra organiske syrer. De højere alkoholer oxideres
langsomt til aldehyder, der sammen med esterne giver vanilleekstraktet
dets fyldige aroma.
Ekstraktionsprocessen udføres af flere aromahuse, heriblandt Danisco.
Vanille er sammensat af mere end 250 aromakomponenter, hvoraf vi
har identificeret mere end 150 af disse, og det gør vanille til
den mest komplekse aroma i verden. Vanillin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde)
udgør langt størstedelen af disse komponenter og vanillin tilskrives
hvad smag og duft angår den karakteristiske vanillearoma. Vanillin
udgør ca. 2% (w/w) af tørstofindholdet i planteekstraktet. Den biokemiske
oprindelse af vanillin er ikke kendt i detaljer, men i den grønne
bælg er vanillin tilstede som -D-glucosid. Under fermenteringsprocessen
hydrolyseres glycosiderne, hvorved de frie aromaer dannes. Øvrige
betydelige komponenter, som bidrager til vanillearomaen er vanillinsyre,
vanillinalkohol, p-hydroxybenzoesyre og p-hydroxybenzylalkohol.
Markedssituationen
Verdensmarkedet for vanillin er ca. 15.000 tons, af hvilke under
1 % udgøres af vanille planteekstraktet. Prisen for dette produkt
er ca. $2000/kg i modsætning til syntetisk fremstillet vanillin,
som sælges for ca. $10/kg. Den væsentlig højere pris for planteekstraktet
skyldes den begrænsede mængde vanillebælge, som er afhængig af skiftende
høstudbytte, grundet klimaet i de pågældende lande (herunder tillige
det politiske og økonomiske), samt ikke mindst den arbejdskrævende
håndbestøvning og efterfølgende behandling, som ovenfor beskrevet.
Syntetisk vanillin fremstilles hovedsagelig udfra udgangsmaterialerne
eugenol, guaiacol eller lignin. Sidstnævnte akkumuleres som affaldsprodukt
i cellulose-industrien. Alle disse kemiske processer involverer
reagenser som nitrobenzen, natriumhydroxid og svovlsyre. De fleste
processer udføres ved høje temperaturer og er derfor energikrævende.
Syntetisk vanillin anvendes enten alene eller som supplement til
planteekstraktet, men syntetisk vanillin er ofte harsk og mangler
den karakteristiske sammensatte aroma fra planteekstraktet.
Biovanillin
Den store prisforskel mellem planteekstraktet og det syntetiske
produkt kombineret med den stigende efterspørgsel efter »naturlige«
aromaer gør, at det er attraktivt at udvikle produktionsprocesser
for vanillin baseret på biokonversion, som opfylder gældende regler
for naturlig. Der er en hurtig udvikling indenfor dette område,
hvor processer baseret på kultiverede planteceller fra vanilleorkidéen
eller plantevævskulturer, prokaryote eller eukaryote mikroorganismer
eller isolerede enzymer som biokatalysatorer beskrives i litteraturen.
Der er adskillige gode oversigtsartikler, der omhandler de forskellige
processser (1,2), men i det følgende beskrives det arbejde, Danisco
Innovation har udført i samarbejde med Danisco’s aroma division,
udviklingsafdelingen hos Danisco Sugar samt Danisco’s pilotanlæg
i Grindsted.
Den bioteknologiske produktion af vanillin kræver et passende substrat.
De mest lovende substrater er isoeugenol, eugenol og ferulasyre
(Fig 2). Eugenol findes i nellikeolie i store mængder, er let at
ekstrahere og er et billigt substrat, med en pris i størrelsesordenen
$5/kg. Isoeugenol er lidt dyrere og findes f.eks. i bark fra grantræer
og olie fra muskatnødder. Ferulasyre er en komponent af cellevæggen
i plantemateriale, f.eks. hvede-, majs, ris- og havreklid, sukkerroepulp
og melasse. Ferulasyre er tilstede i esterificeret form bundet til
galaktose og arabinose på pektinsidekæder og kan frigives på forskellig
vis. En måde er stærk basisk hydrolyse, men en sådan behandling
er ikke forenelig med en »naturlig« proces, som kræver en mikrobiologisk
eller enzymatisk metode.
Ferulasyre som substrat
Hvis ferulasyre fra sukkerroepulp, en sidestrøm fra sukkerproduktionen,
anvendes som startmateriale er følgende trin nødvendige at undersøge:
Frigivelse af ferulasyre estere, hydrolyse af ferulasyre estere
til ferulasyre, udvikling af biokatalysator, biokonversion og endelig
solvent ekstraktion og oprensning af vanillin. En dampbehandling
ved høje temperaturer i kort tid muliggør en ekstraktion af pektin
og hemicellulose. Cellulose forbliver i uopløst form og kan fjernes.
Den ekstraherede pektin indeholder ferulasyre i dets esterificerede
form. En efterfølgende enzymatisk behandling med en enzymcocktail
bevirker en hydrolyse til fri ferulasyre, som herefter kan ekstraheres
med et passende solvent.
Pseudomonas putida omdanner ferulasyre til vanillin og videre til
vanillinsyre (Fig 3) og er en mulig biokatalysator. Udfordringen
ved at bruge denne organisme i en GMO-fri proces består i at mutere
stammen, således at omdannelsen stopper ved vanillin. Mutanter kan
selekteres efter behandling med det kemiske mutagen N-methyl-N’-nitro-N-Nitrosoguanidin
for deres evne til at vokse på vanillinsyre, men ikke vanillin samt
deres evne til at give en positiv reaktion i en farvereaktion med
dinitrophenyl hydrazin, som derivatiserer aldehyder. En enkelt kandidat
har vist sig at give et pænt resultat, når de 3 karakteristiske
parametre for biokonversion vurderes: Slut vanillin koncentration,
omdannelsestid og molært udbytte. Vi har i foreløbige undersøgelser
fundet, at kandidat stammen kan omdanne ferulasyre til vanillin
i op til 1.5 g/l indenfor ca. 24 timer med et molært udbytte på
0.4. Et sådant udbytte for den nævnte omdannelse er ikke tidligere
rapporteret i litteraturen for P. putida (Rønnow og Palmqvist, upubliceret).
 |
| Figur 3. Metabolisme af ferulasyre i Pseudomonas. (Current
opinion in Biotechnology (2000) 11:490-96) |
Det er kendt, at Streptomyces setoni kan anvendes som biokatalysator
i omdannelsen af ferulasyre til vanillin (3). Vi har hentet en sådan
fra ATCC stammesamlingen og i en biokonversion af ferulasyre har
vi opnået en slut vanillin koncentration på ca. 9 g/l indenfor 18
timer med et molært udbytte på 0.9. Anvendes sukkerroe hydrolysat
som substrat, og ikke den rene kommercielle ferulasyre, opnås 5.3
g/l på 31 timer med et molært udbytte på 0.64 (4). (Fig. 4)
 |
| Figur 4. Biokonversion af ferulasyre til vanillin
i Streptomyces setonii. (A) Kommercielt Ferulasyre som substrat
(B) Sukkerroe hydrolysat indeholdende ferulasyre som substrat. |
Sukkerroe pulp indeholder ca 0.8% w/d.w. ferulasyre. I et regneeksempel
produceres 50 tons vanillin. Til en sådan mængde skal der bruges
omkring 20.000 tons roepulp. Regnes der med udbytter på 80-90% i
de enkelte trin vil det akkumulerede udbytte være omkring 40%, hvilket
betyder, at der kan hentes omkring 2.5 kg vanillin per ton pulp.
Investering i et anlæg til at behandle disse mængder roepulp samt
udgifter til den hydrolytiske behandling vil derfor være betydelige.
Selvom ferulasyre findes i rigelige mængder i naturen, er tilstede
i sidestrømme fra forskellige produktionsprocessser, kan omdannes
til vanillin i et enkelt trin med høj produktivitet og deraf følgende
burde udgøre et fremragende substrat for vanillin produktion, er
indvinding som rent materiale svær, hvilket er den største ulempe
ved at benytte dette substrat. Med det nuværende kendskab på området
er det ikke en farbar vej til en levedygtig vanillin produktion.
(Iso)-eugenol som substrat
S. setonii udmærker sig ved, i modsætning til de fleste mikroorganismer,
at være særdeles tolerant overfor vanillin og derfor en fremragende
biokatalysator for vanillin produktion. Det var derfor nærliggende
at undersøge, hvorvidt andre substrater end ferulasyre kan anvendes.
Eugenol og til dels isoeugenol er billige, kommercielt tilgængelige
substrater og en dyr ekstraktionsproces er derfor ikke nødvendig.
Imidlertid er disse substrater kendte antimikrobielle stoffer, men
vores undersøgelser tyder på, at S. setonii kan vokse på eugenol
og til dels på isoeugenol, og er i stand til at omdanne isoeugenol
til vanillin, dog i små mængder. Derudover har vi fundet, at tolerancen
overfor substraterne kan øges ved en tilvænning af organismen (5).
En genetisk modifikation af denne stamme kombineret med optimering
af fermenteringsbetingelser vil eventuelt kunne øge udbyttet tilstrækkeligt
til en kommerciel vanillin proces.
De seneste år er prisen på vanille femdoblet, hvilket skyldes uvejr
på Madagasker, som står for over 50 procent af verdens vanille produktion
(6). Det er derfor mere end nogensinde attraktivt at finde løsninger
på alternativ vanillin produktion. Biovanillin er et godt kontrollerbart
alternativ: miljørigtigt i forhold til syntetisk vanillin og smagsmæssigt
meget tæt på planteekstraktet, idet der under biokonversionen ikke
alene dannes vanillin, men også mindre mængder af fortrinsvis den
tilsvarende alkohol og syre, som bidrager til den kendte vanillearoma.
I litteraturen findes der eksempler på biokonversion med henblik
på at producere vanillin, og vi har anvist en proces, hvor vanillin
produceres fra et overskudsprodukt. Stadigvæk er det en vurdering
om økonomisk rentabilitet jvf. vore egne beregninger kombineret
med en prisfastsættelse af biovanillin. Prisforskellen på syntetisk
vanillin og vanille fra planteekstrakt er en faktor 200 og prisen
på biovanillin vil i fremtiden finde et passende leje her imellem
afhængig af markedsbehovet.
Referencer
- Ramachandra Rao, S. og Ravishankar, G.A. (2000) Vanilla flavour:
production by conventional and biotechnological routes J Sci Food
Agric 80:289-304.
- Preifert, H., Rabenhorst, J. og Steinbüchel, A. (2001) Biotechnological
production of vanillin. Appl Microbiol Biotechnol 56:296-314.
- Muheim, A. og Lerch, K. (1999) Towards a high-yield bioconversion
of ferulic acid to vanillin Appl Microbiol Biotechnol 51: 456-461.
- Gunnarsson, N. og Palmqvist, E.A. (2002) Influence of pH and
carbon source on the production of vanillin from ferulic acid
by Streptomyces setonii ATCC 39116 (submitted)
- Palmqvist E.A. and Rønnow B. (2002) Bioconversion of eugenol
and iso-eugenol by Streptomyces setonii ATCC 39116. (Submitted)
- Danisco Magasinet (2002) nr.3
|
