Anvendelse af krystalstrukturer i biokemisk forskning i dag og i fremtiden

Jette S. Kastrup (jsk@dfh.dk) og Michael Gajhede (mig@dfh.dk), Institut for Medicinalkemi, Danmarks Farmaceutiske Højskole

3-Dimensionelle strukturer og biokemi

Inden for biokemien opstod der allerede på et tidligt tidspunkt et ønske om at kende og forstå strukturen af de biomolekyler, som dannede grundlag for de kemiske processer, man ønskede at studere. Røntgenstråling viste sig i starten af det forrige århundrede at være anvendeligt ved bestemmelse af kemiske strukturer, og der gik ikke mange år før røntgenkrystallografiske undersøgelser af enkeltkrystaller havde blotlagt strukturen af adskillige uorganiske forbindelser og små organiske molekyler. En af de første vigtige biologiske anvendelser af røntgenstråling var pulverstudier af DNA, der som bekendt beviste, at molekylet danner en dobbelthelix.

Figur 1. Eksempel på krystaller af et protein

Der gik herefter en del år, før teknikken kunne anvendes til at få fuldstændig information om makromolekylers, f.eks. proteiners, 3-dimensionelle struktur. Dette skyldes, at det ikke var muligt at anvende de metoder, som blev brugt til at skaffe den helt nødvendige information om fasen af den diffrakterede røntgenstråling af små molekyler og salte. Det viste sig nødvendigt at udvikle helt nye metoder til at løse faseproblemet for makromolekyler, hvilket efterfølgende førte til den første struktur af et biologisk relevant makromolekyle i 1960. Dette var det oxygenopbevarende protein myoglobin, og denne struktur blev bestemt af John Kendrew og samarbejdspartnere. Frem mod i dag kan mange resultater fremhæves, for eksempel den første struktur af det humane leukocyt-antigen molekyle HLA-A2 1, som på det nærmeste revolutionerede immunologisk forskning. I perioden fra 1960 er grænsen hele tiden blevet rykket for hvor komplekse systemer, der har kunnet krystalliseres (figur 1) og analyseres. Af nyere resultater er det derfor umuligt at forbigå strukturbestemmelsen af et intakt ribosom fra bakterien Thermus thermophilus 2. Ribosomet består af to partiker på henholdsvis 30 og 50 Svedberg (S). 30S partiklen indeholder 16S rRNA og 20 proteiner, medens 50S partiklen udover RNA indeholder over 30 proteiner. I alt er ribosomet opbygget af omkring 350.000 ”tunge” atomer udover hydrogenatomerne, hvilket er et foreløbigt maksimum for strukturer, som ikke er højsymmetriske (f. eks. vira). Ribosomets struktur var en af de sidste manglende brikker i den komplette kortlægning af den strukturelle basis for prokariote cellers translation af mRNA til proteiner. Nu kan der opstilles strukturelt funderede hypoteser for, hvorledes ribosomet i samspil med de forskellige translationsfaktorer producerer nye proteiner.

Antallet af kendte strukturer af biologiske makromolekyler er steget eksplosivt i de sidste 10 år. Der er p.t. deponeret omkring 20.000 strukturer i den centrale offentlige databank på Rutgers University. Denne fantastiske udvikling har medført, at der både på nationalt- og på EU-niveau er tilført meget betydelige ressourcer til forskningsområdet. Dette afspejler sig også i antallet af danske proteinkrystallografigrupper, idet antallet siden 1990 er steget fra en til seks. Denne vækst er sket i Øresundsregionen, hvor f.eks. den proteinkrystallografiske gruppe her på Danmarks Farmaceutiske Højskole pt. tæller omkring 20 personer. Der arbejdes med mange projekter, f.eks. med studier af glutamatreceptorer og af intracellulære signaleringskomplekser relateret til allergi. Der samarbejdes i stor udstrækning med bioteknologiske virksomheder fra regionen, bl.a. med Novo Nordisk, Novozymes, Lundbeck og ALK-Abello. I lighed med i udlandet er der nu også selvstændig proteinkrystallografi i en privat virksomhed, idet en aktiv gruppe er etableret på Novo Nordisk.

Der er formodentligt mange grunde til, at antallet af bestemte proteinstrukturer stiger eksponentielt, men ud over de øgede ressourcer er tre forhold uden tvivl af stor betydning: Adgangen til rekombinante proteiner, synchrotroncentrene samt gennemførslen af de store genomsekventeringsprojekter.

Rekombinante proteiner

I dag forudsætter diffraktionseksperimenter på biologiske makromolekyler, at de kan bringes i krystallinsk form. Dette kræver protein (eller DNA/RNA) i milligrammængder til krystallisationseksperimenter. Af denne grund var de første mange proteiner, som blev strukturbestemt, karakteriseret ved at være nemme at isolere i store mængder fra deres naturlige kilde (for eksempel lysozym fra hønseæggehvide). Efter fremkomsten af rekombinante DNA-teknikker er langt de fleste strukturbestemte proteiner fremstillet ved heterolog ekspression. Fremstillingen af rekombinante proteiner er i mange tilfælde rutinepræget og indgår i større proteinkrystallografigruppers arbejdsområder sammen med oprensning af rekombinante proteiner. Langt de fleste grupper anvender imidlertid stadig E. Coli som det eneste værtssystem, men er i færd med at etablere andre ekspressionsystemer, som insektcellesystemer, for at få adgang til flere proteiner af f.eks. human oprindelse.

Synchrotronstråling

Den rivende udvikling op gennem 90’erne inden for forskning med synchrotronstråling har revolutioneret den krystallografiske strukturelle biologi. Set fra strukturbiologens synspunkt har det primært betydet to ting:

• Intensiteten af røntgenstrålingen er blevet mange størrelsesordener højere end den, som kunne leveres af ”in-house” roterende anoder (helt op til en faktor 1012). Dette har betydet, at langt mindre og dårligere diffrakterende krystaller end tidligere viser sig anvendelige til strukturbestemmelse.
• Bølgelængden kan varieres kontinuert i røntgenområdet. På større synchrotroner sker dette uden væsentligt tab af intensitet i det interessante område omkring 1 Å.  Dette har betydet, at anomal spredning fra tungere atomer (som Se) nu rutinemæssigt kan udnyttes til at løse røntgenkrystallografiens faseproblem; et problem der hidtil har været meget tidskrævende at løse. Af særlig betydning er de rekombinante teknikker, hvor aminosyren methionin erstattes af selenomethionin. I dag er fremstillingen af brugbare krystaller faktisk det eneste reelle problem i en strukturbestemmelse.

Figur 2: Der arbejdes med det optiske bord til Cassiopeia målestationen på MAXLAB.

Den stigende anvendelse af synchrotronstråling har medført store stigninger i forskningsgruppernes rejseudgifter. Stort set alle forskningsprojekter inden for strukturel biologi involverer i dag synchrotronstråling, så der er mange rejser til Hamburg (DESY/HASYLAB), Grenoble (ESRF) og Lund (MAXLAB). Heldigvis har Det Naturvidenskabelige Forskningsråd støttet de danske brugere af synchrotronstråling gennem bevillinger til sammenslutningen af synchrotronbrugere. Dette DANSYNC center har endvidere bidraget til udbygningen af MAXLAB’s faciliteter for makromolekylær røntgenkrystallografi, idet prof. Jens Als Nielsen fra Ørsted laboratoriet på Københavns Universitet har designet en målestation, som i realiteten 5-dobler kapaciteten af en konventionel station (figur 2). Denne opstilling er en del af den nye svensk-danske beamline Cassiopiea (http://maxsun5.maxlab.lu.se/beamlines/bli911), der er finansieret af Wallenbergfonden, Det svenske forskningråd VR, Det Danske Bioteknologiske Instrumentcenter (DABIC) og med industriel støtte fra Novo Nordisk og Astra-Zeneca. Det er forventningen, at den kraftige forøgelse af kapaciteten vil betyde et meget stort løft for bioteknologisk forskning i Øresundsregionen. Cassiopeia vil formodentligt komme i ordinær brug i løbet af foråret 2003.

Genomprojekter

I dag kan over 800 organismers komplette genomer findes på internettet, og antallet er stigende. Disse sekvenser er bestemt på genomsekventeringscentre over hele verden og det er muligt at få genomisk DNA herfra. For eukariote genomers vedkommende er det ofte også muligt at få cDNA. Det har betydet, at det er blevet langt lettere at forsøge at udtrykke et givet protein rekombinant. Hvis proteinet er vanskeligt at udtrykke i opløselig form, eller det viser sig umuligt at fremstille krystaller, åbner genomprojekterne rige muligheder for at forsøge at fremstille proteinet fra en anden organisme.

Eksempler på egne forskningsprojekter

Studier af ionotrope glutamatreceptorer
Glutamat anses for at være det vigtigste stimulerende signalstof i hjernen, og stoffet er involveret i mange forskellige funktioner som f.eks. indlæring og hukommelse. Ubalance i glutamat systemet (overstimulering) fører til degeneration af nerveceller. Det sker i en række neurodegenerative sygdomme, som spænder fra den langsomt fremadskridende senilitet i Alzheimers sygdom til akutte hjerneskader, som opstår ved hjerneblødning og hjertestop. Man kender endnu ikke den 3-dimensionelle struktur af en membranbundet glutamat receptor, men ved hjælp af molekylærbiologi og proteinkrystallografi er det blevet muligt at bestemme strukturen af det ligandbindende domæne af glutamat receptorer 3, se figur 3. Denne nye forskning har åbnet vejen for en grundvidenskabelig forståelse for receptorernes funktion og for målrettet design af nye lægemidler mod neurodegenerative sygdomme.

Glutamat receptorer er membranbundne receptorkomplekser, der klassificeres som G-proteinkoblede metabotrope receptorer og ionotrope receptorer. De ionotrope receptorer inddeles videre i tre grupper: NMDA, AMPA og kainat receptorer. For hver af disse grupper er der forskellige receptortyper alt efter, hvilke underenheder receptorerne består af. AMPA receptorerne er proteinkomplekser i cellemembranen, bestående af fire af underenhederne GluR1-4, mens kainat receptorerne er sat sammen af underenhederne GluR5-7 og KA1-2. Det er fornylig lykkedes os at krystallisere det ligandbindende domæne af den ionotrope AMPA receptor subenhed GluR2 i kompleks med adskillige ligander, såvel agonister som antagonister 4;4-6. Strukturerne har givet meget værdifuld information vedrørende bindingsmåde for de forskellige ligander og om mekanismen for receptor aktivering og antagonisme. Studierne har afsløret, at det ligandbindende domæne undergår strukturelle ændringer ved binding af ligander, en såkaldt domænelukning. Denne ændring kan korreleres til den biologiske aktivitet af den pågældende ligand. Den opnåede strukturelle viden, kombineret med funktionelle studier på fuldlængde receptorer, anvendes nu som idegrundlag til den videre syntese af ligander med selektiv virkning på de enkelte receptor underenheder. Studierne foregår i samarbejde med andre forskningsgrupper såvel udenfor som på DFH.

Studier af intercellulær signalering relateret til allergi

Figur 3 Skematisk repræsentation af en membranbundet ionotrop glutamat receptor subenhed. Strukturen af det ligandbindende domæne S1S2 er vist til højre.

Allergi har igennem de seneste årtier udviklet sig til en folkesygdom. I den vestlige verden lider op mod 20 procent af befolkningen af en eller anden form for luftbåren allergi, f.eks. birkepollen-, græspollen- eller støvmideallergi. Allergiske sygdomme er i stadig vækst, så man kan sige at behovet for behandling er stigende. Det er muligt at kurere allergi for visse individer gennem immunoterapi. I immunoterapi udsættes allergikeren for de allergifremkaldende stoffer (allergener) i kontrollerede mængder gennem en længere periode. Denne behandling virker dog ikke for alle, og kan have alvorlige bivirkninger. Det er derfor nødvendigt at forbedre behandlingsformerne, hvilket igen kræver detaljeret forståelse af baggrunden for allergisk sygdom. Allergi har vist sig at være en kompliceret lidelse, som involverer en række forskellige cellulære signaleringskaskader. Allergener optages af antigenpræsenterende celler og præsenteres for immunforsvarets T-celler. Dette leder til differentiering af T-celler til typer, som kan initiere overproduktion af antistoffet IgE i B-celler. IgE binder til receptorer på overfladen af mastceller, og hvis mastcellen eksponeres for intakt allergen, vil det starte en signalkaskade, som resulterer i degranulering af cellen med udskillelse af allergiske mediatorer som histamin til følge. Årsagen til, at visse individer bliver allergiske overfor visse allergener, er ukendt. Forståelse af baggrunden for allergi fordrer studier af udvælgelsen af peptider til præsentation i antigen præsenterende celler og intracellulære signalkaskader i både B-, T- og mast-celler. Man kan søge mål for lægemidler i alle signalkaskaderne eller ved at forbedre immunoterapi ved påvirkning af intakte allergeners krydsbinding af IgE.

Figur 4 Komplekset mellem bet v 1 og et Fab-fragment af et IgG antistof (Mirza et al, 2000).

Vi har gennem de seneste år arbejdet på at skabe forbedrede rekombinante allergener til brug i immunoterapi i nært samarbejde med ALK-Abello A/S. På basis af strukturer bestemt ved hjælp af røntgendiffraktion7-9 har vi designet allergenvarianter til sikker immunoterapi med et minimum af bivirkninger10. Figur 4 viser komplekset mellem birkepollenallergenet bet v 1 og Fab fragmentet af et IgG antistof rettet mod bet v 1. I figuren er bet v 1 molekylet løftet en smule op for at vise epitop og paratop. Arbejdet gav værdifuld viden om ikke-liniære epitopers størrelse og egenskaber, og har spillet en vigtig rolle i arbejdet med at designe sikrere allergivacciner.

Som en videreudvikling af dette arbejde sigter et nyt  projekt (støttet af Lundbeckfonden) mod en forståelse af de involverede signalkaskader på et strukturelt grundlag. Det har i de seneste år vist sig, at de såkaldte adaptormolekyler spiller en central rolle i intracellulær signalering. De danner komplekser med kinaserne, som forestår den egentlige signalering, og deres rolle er således at positionere kinaserne korrekt i forhold til hinanden. Signalkaskaden, der aktiveres i forbindelse med T-celle receptorens genkendelse af et peptid fra et fremmed molekyle (eventuelt et allergen), er velbeskrevet i litteraturen11. Der foreligger dog overordentligt lidt strukturel biologisk viden om de involverede molekyler eller om adaptorer i almindelighed, og slet intet om de komplekser, der dannes mellem kinaserne og adaptorerne i signaleringsprocessen. Kendskabet til dels de indgående molekylers struktur, strukturerne af fragmenter af disse eller komplekser mellem komponenterne vil dels give megen grundvidenskabelig indsigt og uden tvivl også afsløre nye vigtige mål for lægemidler, som ikke kun er af relevans i allergibehandling, men også i bekæmpelsen af en lang række andre sygdomme.

Makromolekylær krystallografi i fremtiden

”Free electron lasers” og tidsopløst krystallografi

Kendskab til een enkelt struktur af et makromolekyle er ikke nok til fuldstændig at fastlægge og beskrive den pågældende funktion af molekylet, da biologiske processer typisk består af flere kemiske reaktioner. Det bedste billede af f.eks. et enzyms katalytiske mekanisme opnås ved at følge proteinet i aktion. Dette dynamiske billede kan opnås ved teknikken ’tidsopløst krystallografi’, hvor ændringer i strukturen ved forskellige trin i den katalytiske reaktion følges og iagttages i kompleks med reaktanter, produkter og intermediater. Det vil formodentlig få stor betydning for dette område, at der netop nu er to installationer under opførsel ved henholdsvis DESY, Hamburg og Stanford Linear Accelerator Center (SLAC), såkaldte ’Free Electron Lasers’ (FEL’s), som inden for de næste ti år forventes at levere den næste generation af røntgenstråling. Under anvendelse af store lineære acceleratorer samt magnetfeltsteknologi udviklet på synchrotroner er det blevet muligt at generere stråling i røntgenområdet, som forudsiges at være en faktor 1010 kraftigere end den, der i dag kan leveres fra de mest intense synchrotronkilder 12.  Dette betyder, at det skulle være muligt at observere diffraktion fra aggregater af ganske få molekyler (nanokrystaller) eller måske endda fra enkelte molekyler. At kunne lave ”krystallografi uden krystaller” har mange implikationer, da man her slipper for de begrænsninger i bevægelsesfrihed, som krystallen medfører. Stråling fra en FEL har en tidsstruktur i femtosekundområdet, hvilket åbner helt nye muligheder for at studere biokemiske reaktioner ved diffraktionsteknikker.

Der er mange problemer, der skal løses, før teknikken er brugbar (f.eks. stråleskader og faseproblemet fra kontinuert spredning), men der hersker betydelig optimisme omkring, at de skal kunne overvindes 13. Der er for os ingen tvivl om, at FEL’s vil revolutionere den diffraktionsbaserede strukturelle biologi og biokemi i almindelighed, hvis deres udvikling prioriteres højt nok i de kommende år.

Universitetsbaserede forskningsgruppers rolle

Med eksplosionen i DNA-sekvens informationen er udfordringen i dag inden for strukturel biologi og biokemi at kortlægge den funktionelle integration af alle makromolekyler i en celle eller i en hel organisme. Det nye fokus inden for forskningen er derfor at forstå makromolekylernes kemiske natur og reaktivitet samt hvordan de fysisk interagerer med deres cellulære naboer. Som en følge af de mange sekventerede genomer er det helt naturligt at satse på initiativer, som sigter mod at bestemme de 3-dimensionelle strukturer af de proteiner, som de identificerede gener koder for. Dette har ført til etableringen af såkaldte ”structural genomics” centre. I USA finansierer National Institute of Health ni centre; derudover er der seks centre, som er dels offentligt dels privat finansierede. I Europa er fire projekter under opstart, og der er to i Asien. Af disse er det japanske RIKEN Structural Genomics Initiative måske det mest ambitiøse og velstrukturerede. Disse centre har forskelligt fokus, idet nogle arbejder på at strukturbestemme samtlige proteiner fra meget primitive organismer og andre fokuserer på at strukturbestemme proteiner involveret i cellulær signalering. Fælles for dem alle er, at de udvikler og anvender ”high throughput” teknikker, altså metoder til at industrialisere de forskellige trin i strukturbestemmelsen. Fra PCR-reaktioner over kloning, ekspression og krystallisation anvendes robotter, og strukturerne af ”target”-proteiner forsøges løst efter relativt simple automatiserede protokoller.

Dette betyder, at alle proteiner, som villigt lader sig udtrykke i E. coli og som krystalliserer nemt, vil blive strukturbestemt i ”structural genomics” centrene. Det betyder videre, at de mindre universitetsbaserede forskningsgrupper bør fokusere på de store udfordringer inden for forkningsfeltet, samt på den detaljerede forståelse af struktur/funktions-relationer. De store udfordringer, som står lige for, er membranproteiner og  store komplekser af makromolekyler involveret i cellulære processer. Der er et stort behov for øget indsigt inden for disse områder; f.eks. kendes strukturen kun af under 20 forskellige membranproteiner.

References

1. P.J.Bjorkman, M.A.Saper, B.Samraoui, W.S.Bennett, J.L.Strominger, and D.C.Wiley, Nature 329 (1987) 506-512.
2. M.M.Yusupov, G.Z.Yusupova, A.Baucom, K.Lieberman, T.N.Earnest, J.H.Cate, and H.F.Noller, Science 292 (2001) 883-896.
3. N.Armstrong and E.Gouaux, Neuron 28 (2000) 165-181.
4. C.Kasper, M.Lunn, T.Liljefors, E.Gouaux, J.Egebjerg, and J.S.Kastrup, Febs Letter In the press (2002).
5. A.Hogner, J.S.Kastrup, J.R.Greenwood, S.B.Vogensen, E.H.Møller, J.Stensbøl, J.Egebjerg, and P.Krogsgaard-Larsen, Pharmacochemistry library 32 (2002).
6. A.Hogner, J.Kastrup, R.Jin, T.Liljefors, M.Mayer, J.Egebjerg, I.Larsen, and E.Gouaux, J.Mol.Biol. 322 (2002) 93.
7. A.Henriksen, T.P.King, O.Mirza, R.I.Monsalve, K.Meno, H.Ipsen, J.N.Larsen, M.Gajhede, and M.D.Spangfort, Proteins 45 (2001) 438-448.
8. O.Mirza, A.Henriksen, H.Ipsen, J.N.Larsen, M.Wissenbach, M.D.Spangfort, and M.Gajhede, J.Immunol. 165 (2000) 331-338.
9. M.Gajhede, P.Osmark, F.M.Poulsen, H.Ipsen, J.N.Larsen, R.J.Joost van Neerven, C.Schou, H.Lowenstein, and M.D.Spangfort, Nat.Struct.Biol. 3 (1996) 1040-1045.
10. J.Holm, G.Baerentzen, M.Gajhede, H.Ipsen, J.N.Larsen, H.Lowenstein, M.Wissenbach, and M.D.Spangfort, J.Chromatogr.B Biomed.Sci.Appl. 756 (2001) 307-313.
11. G.A.Koretzky and P.S.Myung, Nature Rev.Immunol. 1 (2001) 95-107.
12. N.Patel, Nature 415 (2002) 110-111.
13. J.Hajdu, Curr.Opin.Struct.Biol. 10 (2000) 569-573.