Center for BioChips – CBC – er et center uden mure under ledelse
af Bioteknologisk Institut, og består i et samarbejde med 6 danske
private virksomheder, DHI Vand & Miljø, samt BioCentrum DTU.
De 6 virksomheder er Nunc A/S, Novo Nordisk A/S, DNA Technology
A/S, Azign Bioscience A/S, Scandinavian Micro Biodevices A/S og
CelTor Biosystems A/S. CBC er finansieret af en centerkontrakt under
Ministeriet for Videnskab, Teknologi og Udvikling og har eksisteret
siden 1. Januar 2000. CBC blev etableret med det hovedformål at
udvikle forskellige biochip platforme med fokus på optimering og
implementering af teknologi, samt ikke mindst at udvikle praktiske
anvendelser af biochips i en lang række forskellige miniaturiserede
assays.
CBC har i de seneste 3 år opbygget en stærk kompetence indenfor
udvikling, design, produktion og anvendelser af biochips i forskellige
sammenhænge. Biochips er en generel betegnelse for miniaturiserede
systemer/komponenter indeholdende biomolekyler eller biologisk materiale
som basis for en specifik affinitetsreaktion, et cellulært respons,
en katalytisk proces eller anden molekylær interaktion. I CBC har
vi begrænset udviklingsarbejdet til at omfatte to forskellige platforme,
dels microarraying teknologi til dispensering af biomolekyler (DNA
og protein) i nanoliter skala, dels mikrofluid systemer til præcis
positionering af væskestrømme under laminære flowbetingelser ved
hjælp af hydrodynamisk fokusering.
 |
| Figur 1a |
Microarraying af biomolekyler
Da CBC i år 2000 startede sine aktiviteter var der kun få steder
i Danmark, hvor man havde praktiske erfaringer med DNA og protein
microarraying. For at kunne producere DNA- eller protein-chips i
mikroskala er der krav om adgang til robotudstyr. I CBC er der ved
Bioteknologisk Institut, Nunc, Novo Nordisk og Azign Bioscience
investeret i microarray robotustyr, som alle er baseret på det man
kalder kontakt printing, dvs. at prøvematerialet (DNA eller protein)
afsættes på slideoverfladen ved berøring med en nål. Herved afsættes
ca. 1 nL prøve på overfladen, hvilket giver en spot-diameter på
50-200 µm afhængig af overfladens fysisk-kemiske egenskaber og spottingopløsningen.
Denne teknologi gør det muligt at dispensere mange forskellige prøver
med en varierende tæthed - Figur 1B viser f.eks. forskellige DNA
prøver afsat med en tæthed på 375 spots/cm2 på en DNA-chip. Billedet
af DNA-chippen er genereret efter at slideoverfladen er scannet
i en microarray fluorescens scanner i en opløsning på 10x10 µm/pixel.
De fleste microarray applikationer baserer sig på fluorescens assays
og det er derfor ligeledes essentielt at have adgang til fluorescens-scanner
udstyr. I CBC har vi arbejdet med både laser-baserede fluorescensscannere
samt scannere baseret på filtrering af hvidt lys og sekventiel optagelse
af billeder med et CCD-kamera.
 |
| Figur 1b |
Et omfattende optimeringsarbejde blev indledningsvist gennemført
i CBC m.h.p. at opnå tilfredsstillende binding af i første omgang
forskellige former for DNA (PCR-produkter og oligonukleotider) på
forskellige typer af slidesubstrater (dels kommercielt tilgængelige,
dels nye substrater udviklet sammen med deltagende virksomhedspartnere
(Nunc og Scandinavian Micro Biodevices). Senere er metoder til optimal
microarraying af proteiner (antistoffer) også blevet udviklet. Resultatet
af dette fundamentale optimeringsarbejde er at vi i dag har udviklet
effektive metoder og procedurer til produktion og behandling af
DNA- og protein-chips. Vi kan afsætte såvel modificerede som umodificerede
PCR-produkter og oligonukleotider samt antistoffer i mikrospotformat
på både polymerbaserede og glasbaserede slidesubstrater.
 |
| Figur 1c |
Udvikling af mikrofluid baserede biochips
Virksomheden Celtor Biosystems A/S har udviklet en mikrofluid teknologi,
UniqueFlowTM-teknologien, som kan anvendes til såvel molekylær-diagnostiske
som cellebaserede assays.
Med UniqueFlowTM-teknologien kan molekyler eller partikler, som
er opløst i en væskestrøm præcist positioneres og bringes til at
interagere med immobiliserede molekyler eller celler på en chipoverflade.
I den simpleste opsætning består det fluide system af 3 væskestrømme
(Figur 2A). To af væskestrømmene er styrestrømme for en tredje væskestrøm
som indeholder prøvestrømmen. Ved nøje at kontrollere styrestrømmenes
flowhastigheder er det muligt at lokalisere prøvestrømmen så denne
bringes i kontakt med den ønskede del af chip-overfladen, og derved
interagerer med de molekyler eller celler som sidder i det pågældende
område af chippen.
 |
| Figur 2a |
Fordelen ved at anvende en mikrochipplatform til assays er dels
de små prøvemængder (ganske få µL) samt de små dimensioner som i
kombination med væskestrømningen sikrer op til 10.000 gange hurtigere
ligand-receptor assays (antistof-antigen, DNA-DNA eller cellereceptor-ligand
binding) sammenlignet med f.eks. konventionelle ELISA- eller DNA-hybridiseringsassays.
Eksempler på anvendelser af biochips udviklet i CBC
CBC havde i starten fokus på at udvikle og implementere teknologien
indenfor de to definerede hovedområder, men har i den sidste halvdel
af projektperioden primært arbejdet med at demonstrere anvendelsespotentialet
for biochips i en række forskellige sammenhænge.
DNA-chips
Den eksplosive vækst i generering af DNA sekvensdata fra mange
forskellige organismer på genomniveau og det deraf afledte naturlige
ønske om f.eks. at kunne analysere mange eller alle gener fra en
given organisme hurtigt og effektivt har været forudsætningen for
udviklingen af DNA-chip-teknologien. Produktion af DNA-chips med
en høj tæthed af specifikke DNA-spots i mikroformat har gjort det
muligt at gennemføre sådanne analyser. I CBC har vi arbejdet med
forskellige biologiske systemer med det fælles mål at gennemføre
gen-ekspressionsanalyser på mange gener samtidig gående fra det
vi kalder low-density arrays, hvor udgangpunktet er 30-200 gener,
til high-density arrays, hvor op til flere tusinde geners ekspression
analyseres. På BioCentrum DTU arbejdes der med DNA-chip-pioneren
Affymetrix GeneChip med henblik på undersøgelser af Saccharomyces
cerevisiae. På Novo Nordisk er der udviklet en DNA-chip med mere
end 2000 gener fra mus til studier af diabetes relaterede problemstillinger.
Azign Biosciences har ligeledes udviklet high-density array med
flere tusinde gener (og ESTer) fra mus. De to sidstnævnte high-density
array-typer er begge baserede på immobilisering af PCR-produkter
ved kontaktprinting, hvorimod Affymetrix GeneChip formatet er baseret
på immobiliserede oligonukleotider syntetiseret direkte på chippen
vha. fotolitografisk maske-teknologi kendt fra computer-chip teknologien.
De andre DNA-chips kan produceres in-house, og dermed tilpasses
ens specifikke behov.
På Bioteknologisk Institut er der arbejdet med at udvikle genekspressionanalyser
baseret på low-density arrays. I samarbejde med forskellige forskningspartnere
er der etableret low-density arrays til studier af dels af cancer
relateret genekspression i muse celler og tumorer, dels af virulens-
og stress-mekanismer i Salmonella enterica serovar Typhimurium,
og dels af forskellige signaltransduktionsmekanismer samt resistensudviklingsmekanismer
i Listeria monocytogenes. Disse low-density arrays er blevet anvendt
til at optimere på procedurer for genekspressionanalyser, hvor man
bruger den såkaldte dobbelt-mærkningsteknik til at sammenligne genekspressionsprofiler
for de udvalgte gener på DNA-chippen for to forskellige tilstande
af den samme organisme. Et eksempel på en sådan analyse er afbildet
i Figur 1B og 1C. En vildtype L. monocytogenes er sammenlignet med
en isogen mutant (arbejdet er lavet i samarbejde med Anne Gravesen,
Mejeri- og Levnedsmiddelinstituttet, KVL). Intensiteten af fluorescenssignal
giver et fingerpeg om ekspressionsniveauet for det enkelte gen i
mutanten og/eller vildtypen. Farven af spotfluorescensen fortæller
noget om reguleringen af det enkelte gen – f.eks. i dette tilfælde
indikerer en rød fluorescens, at genet enten er lukket ned i vildtypen
eller er kraftigt opreguleret i mutanten, og en grøn fluorescens
at genet er lukket ned i mutanten eller er opreguleret i vildtypen.
Gule spots repræsenterer gener som ikke er regulerede. En hensigtsmæssig
måde at afbilde resultatet af en sådan ratio-analyse er vist i scatterplottet
i Figur 1C. De røde trekanter i scatterplottet repræsenterer således
gener som er mere udtrykt i mutanten end vildtypen og omvendt de
grønne spots repræsenterer de gener som er mest udtrykt i vildtypen.
Gener som ligger omkring diagonallinien er ikke regulerede.
Mikrofluid baserede immunoassays
CelTor Biosystems og Biocentrum-DTU samt Bioteknologisk Institut
har udviklet en række immunokemiske og DNA baserede assays, der
alle kan udføres indenfor få sekunder under laminære flow-betingelser
vha. hydrodynamisk fokusering. Som demonstrationseksempel er der
i Figur 2 vist et immunoassay for bestemmelse af C-reaktivt protein
(CRP). CRP er en generel markør i blodet for kritisk sundhedstilstand
og indgår bl.a. som en del af immunresponset overfor mikroorganismer.
I det viste eksempel er et polyklonalt CRP-antistof immobiliseret
på en polymer-chip overflade. Chippen monterers i det mikrofluide
system og vha. hydrodynamisk fokusering er forskellige koncentrationer
af CRP i PBS sekventielt positioneret i forskellige 50 µm lanes
på chippen. For at detektere det bundne CRP-antigen fokuseres efterfølgende
præcist i de samme lanes et Cy3-mærket CRP-antistof. Immunoassayet
er gennemført med et flow på 4 µL/s i løbet af kun 2 sekunder pr.
trin. Af den kvantitative analyse af signalintensiteten i de enkelte
lanes kan det konstateres, at der under disse betingelser opnås
en mætning i signal på mellem 5 og 10 mg/L CRP, og der er kun en
svag grad af uspecifik binding af Cy3-anti-CRP til den lane som
ikke har været eksponeret for CRP (0 mg/L).
 |
| Figur 2b |
Andre biochip applikationer i CBC
Etablering og udvikling af biochip-konceptet i CBC har ikke kun
været begrænset til de viste eksempler ovenfor. Udviklingen af miniaturiserede
bioassays har også omfattet etablering af metoder til f.eks. at
kunne arbejde med og studere levende celler (f.eks. mammale og gær)
i mikrofluid systemet (CytoChipTM), design og test af 16S rRNA oligonukleotid
DNA-chips til specifik identifikation af patogene mikroorganismer
i drikkevand baseret på hybridisering og detektion af fluorofor-mærkede
16S rDNA konsensus-PCR-produkter (i samarbejde med DHI Vand &
Miljø), og optimering og demonstration af anvendelsen af antistof
microarrays i en analog dobbeltmærkningsteknik til den som anvendes
ved genekspressionsanalyser, men her altså med udgangspunkt i mærkning
af protein-fraktioner fremfor mRNA.
I visse applikationer har vi også bragt biochip-konceptet meget
tæt på en mulig praktisk implementering i lægeklinikken eller i
analyselaboratoriet. F.eks. har vi demonstreret, at det er muligt
at måle på blodkomponenter i det mikrofluide system, og at det er
muligt at måle på stoffers cytotoksiske effekt i det mikrofluide
system ved eksponering af levende mammale celler.
 |
| Figur 2c |
Det bør også nævnes at andre aktiviteter i CBC har haft fokus på
fortolkning og behandling af store datamængder i form af genekspressionsdata
fra mange forskellige gener under mange forskellige betingelser
ved at gøre brug af nogle af de nye bioinformatiske værktøjer, som
er helt essentielle for at kunne overskue og gennemskue komplekse
sammenhænge. I den sammenhæng har vi bl.a. demonstreret explorative
multivariate dataanalysemetoders relevans som alternativ eller supplement
til de mere klassisk orienterede statistiske metoder til gruppering
og analyse af komplekse datasæt.
Et større tværgående samarbejde i CBC er bl.a. i gang mellem Novo
Nordisk, Azign Biosciences, BioCentrum DTU og Bioteknologisk Institut
med det formål at evaluere robustheden i DNA-chip baserede genekspressionsanalyser
ved at lave analysen på forskellige lokaliteter og med forskellige
DNA-chip platforme dækkende spektret fra low-density arrays med
20 gener til high-density Affymetrix GeneChip arrays med flere tusinde
gener.
Efter CBC
I forhold til de milepæle og mål der oprindeligt blev sat ved etableringen
af Center for BioChips kan vi konstatere, at vi med stor succes
har formået at leve op til disse og i vid udstrækning gennemført
de planer, som blev udstukket for snart mere end 3 år siden. Men
dermed er det ikke slut - man kan snarere sige at det med afslutningen
af centerkontrakten først rigtig for alvor begynder. I gennem 3
år har virksomheder, universitetsinstitutioner samt ikke mindst
de involverede godkendte teknologiske serviceinsistitutter (GTS)
i CBC via en stor offentlig finansiering på godt 10 mio. kroner
opbygget en solid kompetence indenfor udvikling og anvendelse af
biochips. For de involverede GTS-institutters vedkommende handler
det nu om at sikre, at de opbyggede kompetencer i form af serviceydelser
og kontraktforskning markedsføres og tilbydes en bred kreds af kunder
primært i Danmark omfattende private virksomheder og forskningsinstitutioner.
Bioteknologisk Institut kan i den sammenhæng tilbyde at designe
og producere low-to-medium DNA-chips (<400 spots/cm2) til diverse
applikationer herunder genekspressionsanalyser. Herudover tilbydes
at scanne og analysere DNA-chips (såvel in-house producerede som
andre kommercielt tilgængelige DNA-chips). Øvrige DNA-chip baserede
applikationer som også tilbydes omfatter bl.a. chips til genotypning
og mikrobiel diagnostik. UniqueFlowTM systemet er ligeledes bragt
til et niveau, hvor cellebaserede assays, f.eks. hurtige brugerdefinerede
toksikologiske screeningsanalyser er praktisk anvendelige.
For øvrig information om samarbejde, muligheder og services rettes
henvendelse til Centerleder Kim Holmstrøm, Bioteknologisk Institut,
(e-mail: kho@bioteknologisk.dk).
|
