Traditionelt belyses proteiners funktion gennem revers genetiske
studier, hvor et givet proteins aktivitet eller udtrykkelse blokeres
for derefter at iagttage den fremkomne fænotype. Dette kan opnåes
via ekspression af en dominant negativ isoform, introduktion af
strukturelle mutationer eller ved antistof injektioner. De genetisk
baserede fremgangsmåder er pålidelige, men desværre også meget arbejdskrævende,
og derfor er alternative strategier udviklet. Via antisense RNA
har man forsøgt at påvirke udtrykkelsen af specifikke proteiner
ved at blokere mRNA translationen, men metoden giver svingende resultater.
For at kunne automatisere bestemmelsen af proteiners funktion vha.
revers genetiske studier, kræves derfor en hurtig, specifik og robust
fremgangsmåde til at eliminere et givet proteins ekspression.
I 1998 rapportede Andrew Fire, at dobbeltstrenget RNA (dsRNA)
potent og specifikt kan nedregulerere ekspressionen af de komplementære
gener i nematoden Caenorhabditis elegans (Fire et al., 1998).
Fænomenet blev kaldt RNA interferens (RNAi), og lige siden er der
arbejdet intenst for at forstå den bagvedliggende molekylære mekanisme.
I dag benyttes RNAi som værkøj i hele organismer og forskellige
cellelinier. Hvert enkelt gen på kromsom I og III i C. elegans
er blevet supresseret og fænotypen bestemt, og i mammale cellekulturer
undersøges det, hvorvidt RNAi kan benyttes i terapeutisk øjemed.
RNA interferens, en cellebiologisk revolution
I midten af 90’erne eksperimenterede Guo og Kemphues med at nedregulere
genekspressionen af Par-1 i C. elegans med antisense
RNA, men observerer til deres overraskelse, at kontrolforsøget med
sense RNA ligeledes fører til specifik hæmning af gen udtrykkelsen
(Gou og Kemphues 1995). Denne observation lignede, hvad der førhen
var demonstreret i svampe, benævnt quelling, samt i planter
kendt som co-suppression og senere Post-Translational
Gene Silencing (PTGS). Selvom Gou og Kemphues resultater var
et mysterie, blev der ikke draget paralleller til observationerne
i planter og svampe.
Først i 1998 udførte Fire og Mello en række eksperimenter, som
kunne forklare, hvad deres kolleger tidligere havde set. I deres
antisense RNA forsøg med C. elegans opdager de, at dsRNA
har kontamineret både sense og antisense RNA præparaterne, og faktisk
er ansvarlig for gennedreguleringen. Efterfølgende viste de, at
dsRNA nedsætter genekspressionen ca. 100 gange mere effektivt end
antisense RNA, samt at injektion af dsRNA i tarmen på C. elegans
ikke blot hæmmer genekspressionen i hele dyr, men også i dets første
generations afkom (Fire et al., 1998). Metoden viste sig hurtigt
at være brugbar mod en bred vifte af gener i C. elegans,
og snart blev RNAi et værdsat værktøj i forskellige organismer såsom
bananfluer (Drosophila melanogaster), zebrafisk (Danio
renio), andemad (Arabidopsis thaliana), bakterier (Escherischia
coli), og svampe (Neurospora crassa). RNAi effekten hos
disse organismer induceres af lange dsRNA molekyler (ca 700 bp).
Dette gør, at denne metode ikke direkte kan overføres til mammale
celler, idet disse er udstyret med et forsvarssystem, interferon
responset, som er rettet mod viralt dsRNA og transposon elementer.
Responset omfatter aktivering af en dsRNA responsiv protein kinase
(PKR) samt 2’,5’ oligoadenylat syntasen (2’, 5’ OAS) og udløses
ved tilstedeværelsen af selv ekstremt små mængder dsRNA (over 30
bp). Aktivering af PKR og 2’, 5’ OAS syntasen fører til henholdsvis
inaktivering af translations initieringsfaktor eIF2a og aktivering
af RNase L resulterende i global uspecifik supression af translationen,
mRNA nedbrydelse og apoptose (Stark et al., 1998).
I år 2000 blev de første mammale RNAi forsøg udført på udifferentierede
embryonale stamceller fra mus (Yang et al., 2001). Inducering af
RNAi med lange dsRNA molekyler i disse celler medfører ikke aktivering
af interferon responset, og resulterer derfor i specifik gennedregulering.
Samme forsøg blev udført i differentierede celler, hvilket førte
til udløsning af interferon responset og dermed global gensupression.
Omtrent samtidigt opdagede Zamore under en række RNAi eksperimenter
i Drosophila embryo lysater, at de lange dsRNA molekyler,
der benyttes til inducering af RNAi, processes til små dobbeltstrengede
fragmenter på 21-23 nukleotider under progressionen af RNAi (Zamore
et al., 2000). dsRNA molekyler af denne størrelse ophobes ligeledes
ved RNAi induktion i C. elegans (Parrish et al., 2000) og
planter (Hamilton og Baulcombe, 1999). I Tuschl’s laboratorie viste
man, at disse korte RNA fragmenter, kaldet små interferende RNA’er
(siRNA), kan inducere RNAi i bananfluer og mammale celler, og p.g.a.
deres størrelse fører de ikke til aktivering af det mammale interferon
system (Elbashir et al., 2001). Derimod virker siRNA mindre potent
som aktivatormolekyle for RNAi i C. elegans, planter og svampe
celler (Zamore 2002).
Den molekylœre mekanisme bag RNA interferens
Efter det stod klart, at lange dsRNA molekyler bliver omdannet
til siRNA, blev arbejdet med at opklare de bagvedliggende molekylære
mekanismer i RNAi intensiveret. Zamore fandt, at de homologe mRNA
molekyler kun kløves i regionen svarende til det introducerede dsRNA,
samt at dette sker med 21-23 nukleotiders mellemrum (Zamore et al.,
2000). Disse og andre opdagelser udgør fundamentet for den model
af RNAi mekanismen, som er præsenteret i figur 1.
 |
Figur 1. Den molekylære mekanisme bag RNA interferens.
I cellen spalter enzymet Dicer dsRNA til aktive siRNA molekyler,
der efterfølgende indbygges i det inaktive RNA-induced Silencing
Complex (RISC). I komplekset opspaltes siRNA, hvilket medfører
en aktiverende konformationsændring. Det aktive RISC kompleks
benytter siRNA sekvensen til specifikt at lokalisere og nedbryde
de homologe mRNA molekyler. |
Modellen er baseret på eksperimenter i bananfluer, men de grundlæggende
træk formodes at være bevaret i mange forskellige arter. Det RNase
III lignende enzym Dicer katalyserer fordøjelsen af dsRNA til siRNA
molekyler, hvorefter disse indbygges i RNA-Induced Silencing
Complex (RISC), som består af flere forskellige proteiner med
bl.a. endonuklease og helicase aktivitet (Bernstein et al., 2001).
I komplekset opsnoes siRNA dupleksen, hvilket fører til strukturelle
ændringer og aktivering af RISC, som efterfølgende benytter sekvensen
fra antisense siRNA strengen til specifikt at lokalisere og nedbryde
de homologe target mRNA molekyler (Zamore 2002).
Design og introduktion af RNAi aktiveringsmolekyler
En række optimeringsforsøg har vist, at de mest potente siRNA molekyler
er 21 nukleotider lange med 2 nt 3’ overhæng, dog synes sekvensen
af disse overhæng ikke at være kritisk. Grundet mRNA’s sekundære
strukturer er effektiviteten af gennedreguleringen også afhængig
af target mRNA sekvensen, da visse regioner, p.g.a. lokal foldning,
er mindre modtagelige for nedbrydning. For at kompensere for dette,
designes ofte 3-4 forskellige siRNA’er rettet mod forskellige regioner
af target mRNA for efterfølgende at evaluere den enkeltes effektivitet.
Som supplement til siRNA, kan små hairpin RNA (shRNA) molekyler
konstrueres til at hæmme ekspressionen af specifikke gener i f.eks.
mammale cellekulturer. Suppresionen kan fremtvinges ved at transfektere
cellerne med exogent syntetiserede hairpin RNA’er eller via ekspression
af gener kodende for shRNA in vivo, hvorved det er muligt
stabilt at udtrykke shRNA og derved opnå vedvarende RNAi effekt.
Sidstnævnte metode kan muligvis benyttes til fremstilling af transgene
dyr samt i udviklingen af nye terapeutiske strategier.
Til dags dato har injektion og transfektion af dsRNA været de mest
anvendte metoder til intracellulær levering af siRNA, dog kan RNAi
også induceres ved f.eks. at fodre C. elegans med transgene
bakterier, der udtrykker dsRNA, eller ved at tilsætte dsRNA direkte
til vœkstmediet. Hvor RNAi effekten kan nedarves i C. elegans,
er nedregulering af genekspressionen transient i mammale celler,
hvilket sætter restriktioner for anvendelsesmulighederne. For at
overkomme denne begrænsning er der udviklet ekspressionsvektorer,
som kontinuerligt udtrykker siRNA i stabilt transfekterede mammale
cellelinier (figur 2).
 |
Figur 2.RNA interferens i laboratoriet. Metoder til introduktion
af dsRNA molekyler i forskellige cellekulturer og organismer. |
Fremtidige perspektiver, RNAi i terapeutisk øjemed
De potentielle muligheder, der ligger i anvendelsen af siRNA medieret
gennedregulering i mammale celler, er utrolig fascinerende, men
optimal udnyttelse af dette nye værktøj kræver dog en indgående
forståelse af aktivatormolekylernes sekvens og strukturelle opbygning.
Korrekt genkendelse af target er vitalt, og selv små mismatches
mellem siRNA/shRNA og target mRNA resulterer i en markant reduktion
i evnen til at inducere RNAi, hvorfor stabil udtrykkelse af siRNA
muligvis kan benyttes til at nedregulere ekspressionen af mutante
alleler af f.eks. onkogener eller tumor supressor gener uden at
påvirke ekspressionen af vild-type allelen.
Anvendelsen af RNAi i humane celle linier er lidt mere end et år
gammel. Der er dog allerede nu flere indikationer på, at de specifikke
og højpotente siRNA har potentiale som terapeutiske lœgemidler.
De seneste resultater har vist, at siRNA rettet mod HIVs target
receptor, CD4, og HIV proteinerne Gag og Rev kan reducere virus
infektioner i mammale cellekulturer (Novina et al., 2002). Disse
eksperimenter demonstrerer, at siRNA teknologi kan benyttes til
hæmning af forskellige trin i HIV’s livscyklus.
Hidtil er alle mammale RNAi forsøg udført i cellekulturer, og
derfor vakte det stor opsigt, da det for nyligt lykkedes et forskerhold
at inducere RNAi i mus (McCaffrey et al., 2002), hvilket er et stort
skridt på vejen mod det ultimative mål; brugen af RNAi i mennesker.
De seneste RNAi-studier har taget den videnskabelige verden med
storm, og i fremtiden kan denne teknik vise sig at være anvendelig
til udviklingen af genspecifikke therapeutika. Indtil nu er meget
blevet lært omkring denne revolutionerende teknik, og ny information
publiceres næsten dagligt. Det er ikke en overdrivelse at sige,
at RNAi er revolutionerende inden for funktionel genomics.
Referencer
Bernstein E., Caudy A. A., Hammond S. M. & Hannon G. J. Role
for a bidentate ribonuclease in the initiation step RNA interference.
Nature. 409, 363-366 (2001)
Elbashir S. M., Harborth J., Lendeckel W., Yalcin ., Weber K. &
Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference
in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498
(2001)
Elbashir S. M., Martinez J., Patkaniowska A., Lendeckel W. &
Tuschl T. Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi
in Drosophila melanogaster embryo lysates. EMBO J.
20, 6877-6888 (2001)
Fire A., Xu S, Montgomery M. K., Kostas S. A., Driver S. E. &
Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded
RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391 806-811(1998)
Gou S. & Kemphues K.J. Par-1, a gene required for establishing
polarity in C. Elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr
kinase that is asymmetrical distributed. Cell. 81,
611-620 (1995)
Hamilton A. J. & Baulcombe D. C. A species of small antisense
RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science.
286, 950-952 (1999)
McCaffrey A. P., Meuse L., Pham T.-T. T, Conklin D. S., Hannon
G. J. & Kay M. A. RNA interfernce in adult mice. Nature.
418, 38-39 (2002)
Novina C. D., Murray M. F., Dyxhoorn D. M., Beresford P. J., Riess
J., Lee S., Collman R. G., Lieberman J., Shankar P. & Sharp
P. A. siRNA directed inhibition of HIV-1 infection . Nature Medicine.
8, 681-686 (2002)
Parrish S., Fleenor J., Xu S., Mello C. & Fire A. Functional
anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two
trigger strands in RNA interference. Mol. Cell. 6,
1077-1087 (2000)
Stark G. R., Kerr I. M., Williams B. R., Silverman R. H. &
Schreiber R. D. How cells respond to interferons. Annu. Rev.
Biochem. 67, 227-264 (1998)
Yang S., Tutton S., Pierce E., & Yoon K. Specific Double-Stranded
RNA Interference In Undifferentiated Mouse Embryonic Stem Cells.
Molecular and Cellular Biology. 21, 7807-7816 (2001)
Zamore P. D. Ancient pathways programmed by small RNAs. Science.
296, 1265-1269 (2002)
Zamore P. D., Tuschl T., Sharp P.A. & Bartel D. P. RNAi: Double-stranded
RNA directs the ATP dependent cleavage of mRNA at 21-23 nucleotides
interval. Cell. 101, 13437-13441 (2000)
|
