Dimorfiske svampe: fascinerende mikroorganismer i bioteknologi og biomedicin

José Arnau, Head of department, Dept. of Fungal Biotechnology, Biotechnological Institute, jar@bioteknologisk.dk

Svampe -herunder gær og skimmelsvampe er mikroorganismer, der har gennem århundrede været anvendt i traditionel bioteknologi (f.eks. ølbrygning) og biomedicin (f.eks. penicillin produktion). Der er beskrevet over 50000 forskellige svampearter ved hjælp af morfologiske og fysiologiske karakteristika. Dette tal antages at repræsentere kun 5 % af de eksisterende svampearter på jorden. Svampe har også været anvendt i moderne bioteknologi som produktionsorganismer til rekombinant protein produktion af f.eks. insulin, bulk-enzymer, ingredienser, m.m. En særlig klasse af svampe, de såkaldte dimorfiske svampe, kan vokse både som gær og som filamentøse svampe afhængigt af forskellige fysiske og fysiologiske parametre. Dimorfiske svampe findes i alle taksonomiske hovedgrupper af svampe. Regulering af morfologiskiftet i dimorfiske svampe har et lovende anvendelsespotentiale til udvikling af en ny produktionsteknologi. Dette bliver gennemført i et dansk samarbejdsprojekt mellem afdeling for Svampebioteknologi, Bioteknologisk Institut, to forskningsgrupper og tre bioteknologiske virksomheder. Ydermere, nogle dimorfiske svampe udgør en gruppe humane patogener såsom Candida albicans hvor netop skiftet i morfologi er associeret med infektion. Der findes ikke i dag effektive midler til behandling af sådanne infektioner. En forståelse af mekanismerne bag dimorfisme er derfor vigtigt og kan bruges til udvikling af nye antifungale antibiotika.

Produktionsteknologi til rekombinant protein produktion

Nye opfindelser inden for bioteknologi funderes i mange tilfælde på fremstilling og anvendelse af et protein, som ikke kan udvindes fra den naturlige kilde i tilstrækkelig mængde. Proteinet kan i så fald fremstilles ved hjælp af rekombinant DNA-teknologi, det vil sige, at proteinet produceres efter indsættelse af det relevante gen i en fremmed produktionsorganisme så som en bakterie eller en svamp.

Adgang til og know-how vedrørende produktionssystemer til rekombinante proteiner er i dag flaskehalsen for, at mange bioteknologiske ideer kan føres til kommerciel succes. En lang række af de eksisterende produktionssystemer er udviklet af virksomheder, der bruger systemerne til egenproduktion af rekombinante proteiner, og disse systemer er ikke tilgængelige for andre virksomheder.

Produktionssystemer baseret på svampe er karakteriseret ved at være økonomisk effektive (lav produktionspris pr. enhed), egnede til produktion i stor skala og fleksible (mange produktmuligheder p.g.a. systemets biologi). Derfor er det attraktivt at anvende svampe-baserede produktionssystemer og det er vores mål, at udvikle et nyt system, der vil være tilgængeligt for danske virksomheder.

Dimorfiske svampe som alternativ til eksisterende produktionssystemer

Eksisterende svampe-baserede produktionssystemer inkluderer gær (f.eks. Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris) og skimmelsvampe (f.eks. forskellige Aspergillus arter). Procesteknisk har anvendelse af gær eller svampe hver sine fordele og ulemper. Gærceller deler sig og giver anledning til flere celler. Dermed kan man opnå en homogen kultur med høj celletæthed. Skimmelsvampe udviser en stor udskillelseskapacitet gennem enden af de voksende filamenter. Dog er høje biomasse niveauer associeret med sammenfiltrede filamenter, høj viskositet og ikke optimal opblanding af kulturen (Figur 1A), hvilket kan være begrænsede for produktion af det ønskede protein.

En særlig klasse af svampe, de såkaldte dimorfiske svampe, kan vokse både som gær og som filamentøse svampe afhængigt af forskellige fysiske og fysiologiske parametre. Udvikling af et system, der udnytter fordele fra både gær (homogen vækst) og filamentøse svampe (effektiv udskillelse af proteiner) burde derfor være et attraktivt alternativ til eksisterende systemer (Figur 1B). Den idé blev forfulgt i Afdeling for Svampebioteknologi, Bioteknologisk Institut som i samarbejde med virksomheder og forskningsgrupper har etableret et forsknings og udviklingsprojekt organiseret i EUKA-centret.

Figur 1. A) Under fermentering af filamentøse svampe (Mucor voksende aerobt) er den ønskede morfologi ’dispersed’ (venstre). Ved højere biomasseniveauer bliver filamenterne sammenfiltrede (højre), hvilket nedsætter den aktive biomasse; B) Ved anvendelse af en dimorfisk svamp kan man designe en proces bestående af en vækstfase med gærmorfologi og en produktionsfase hvor induktion af filamentering samt ekspression af det ønskede gen sker. Mucor udviser hurtig vækst af filamenter (billedet til højre er taget kun 4 timer efter skiftet fra anaerob til aerobvækst).

EUKA-Center

EUKA-center (akronym for ’Svampe som Eukaryote Produktionsorganismer i Rekombinant Protein Produktion’) er en centerkontrakt støttet af Erhvervsfremme Styrelsen (se boks), hvis hovedmål er at udvikle et Mucor-baseret system til rekombinant protein produktion.

Valget af Mucor som produktionsorganisme er afledt fra en afvejning af på den ene side muligheden for rettighedsbeskyttelse samt Mucors cellebiologi og vækstkarakteristika og på den anden side det manglende kendskab til gener og metaboliske processer, der er typisk for ikke-model systemer som Mucor.

To forskningsgrupper (Prof. Jens Nielsens gruppe, Biocentrum-DTU, med speciale inden for fermenteringsprocesser og svampemorfologi og Prof. Per Amstrup Pedersens gruppe, August Krogh Instituttet, Københavns Universitet, specialiseret i udskillelsesprocesser og analyse af membranprotein produktion i gær) og tre bioteknologiske virksomheder (Danisco-Cultor, Novozymes og Unizyme) deltager i EUKA-center.

De første udfordringer har været at finde, udvikle og afprøve diverse genetiske værtøjer til genekspression (stærke regulerbare promotorer, selective markører m.m.) samt etablere fermenteringsprocesser for Mucor.

Figur 2. Produktion af rekombinant glukoseoxidase fra Aspergillus niger i Mucor. Produktionsstammer med ekspressionskassetten på episomal plasmid (venstre) viser kun aktivitet i nogle få kolonier (mørke områder) p.g.a. lavt kopital. Efter stabil integration af samme ekspressionskassette på kromosom, producerer alle kolonier aktivt GOX (højre).

DNA introduceret i Mucor med de eksisterende transformationsprocedurer opretholdes som frit (episomalt) plasmid. Dette betyder genetisk ustabilitet og lavt kopital -også når Mucor vokser i selektivt medie (Figur 2). DNA integration, som er vigtigt for konstruktion af robuste produktionsstammer, sker meget sjældent i Mucor. For nylig er det lykkedes at opnå integration og dermed en betydelig forbedring i produktion af et heterologt protein, glukose oxidase fra Aspergillus niger (Figur 2).

Parallelt er der blevet arbejdet med karakterisering og optimering af betingelserne for dyrkning af Mucor i fermentor. Mucor vokser som gær under anaerobe betingelser men allerede i det indledende arbejde blev det klart at anaerob vækst resulterer i en høj etanol produktion, væksthæmning og dermed lav biomasse.

For at kunne genetisk styre morfologien i Mucor er gener, der kontrollerer det dimorfiske skift, blevet identificeret og karakteriseret. Et af disse gener er pkaR, der koder for den regulatoriske subunit af cAMP-afhængige protein kinase A (betegnet PKAR). Protein kinase A aktivitet er represseret af PKAR og denne regulering er vigtig for filamentering. Vi har vist, at overekspression af pkaR i Mucor resulterer i en øget filamentering hvilket medfører en øget udskillelseskapacitet idet proteinsekretion foregår via hyfespidserne. At PKAR er nødvendigt for filamentering er vist ved at konstruere stammer med en mutation i pkaR, der vokser som gær under aerobe betingelser (Figur 3).

Figur 3. En mutation i pkaR resulterer i gærmorfologi under aerobvækst. Vildtypestamme (venstre) vokser som filamenter under aerobe betingelser mens pkaR mutant (højre) vokser overvejende som gærceller under samme betingelser.

Med de opnåede resultater blev der indleveret en patentansøgning i marts 2001.

Nuværende forskning er bl. a. rettet mod etablering af en proces til kontinuerlig fermentering af Mucor. Dette er et vigtig redskab til optimering af dyrkningsbetingelser, genekspression og -regulering, m.m. En moderne opsætning med automatiseret overvågning er blevet etableret på Bioteknologisk Institut til formålet og vil også kunne anvendes til optimering af andre fermenteringsprocesser for såvel model (Aspergillus, Pichia og Saccharomyces) som ’ikke konventionelle’ (Mucor, Geotrichum, m.fl.) svampe. High throughput screening vil også anvendes til fremstilling af optimerede produktionsstammer.

Perspektiver

En prototype af Mucor systemet vil bestå af en aerob voksende gær stamme –formentligt med ændret protein kinase A aktivitet, indholdende en ekspressionskassette med en regulerbar promotor integreret i genomet. Prototypen vil blive afprøvet med forskellige virksomheds relevante proteiner i den kommende periode. Applikationsforsøg med Mucor-producerede rekombinante proteiner vil danne grundlag til en vurdering af systemets potentiale.

I afdeling for Svampebioteknologi forventer vi at udvikling af Mucor systemet i de kommende år vil betyde at man kan tilbyde andre bioteknologiske virksomheder og forskningsgrupper adgang til og teknologisk know-how vedrørende produktion af rekombinante proteiner. Allerede nu forsøges med produktion af et humant protein med potentiale som terapeutika i Mucor systemet.

Medicinske aspekter af dimorfiske svampe som et nyt forskningsområde

Afdeling for Svampebioteknologi har, via arbejdet i EUKA-centret, opbygget en kompetence indenfor regulering af morfologiændringer i dimorfiske svampe. Denne gruppe af svampe indeholder også andre, mindre uskyldige dimorfiske svampe, navnlig patogener såsom Candida albicans. Denne svamp optræder normalt hos raske mennesker uden at være sunhedsfarlig. Men i mennesker med et svækket immunsystem (såsom HIV-, transplantations- eller kræftpatienter) skifter Candida fra den uskadelig (gær) morfologi til filamentøs morfologi og resulterer i en systemisk infektion som kan være letal (>40 % af patienter med systemisk candidiasis dør). Der findes i dag kun få antibiotika til behandling af sådanne infektioner. Desværre er der toksiske bivirkninger og forekomsten af resistente isolater er stærk stigende.

I samarbejde med Biocentrum-DTU og med støtte fra ATV til et erhvervsforsker projekt forsøger vi at tage de første skridt i udviklingen af nye antifungale antibiotika ved at fokusere på netop kontrollen af morfologiændringer i Candida.

I dette meget konkurrence prægede bioteknologiske område skal man igen, ligesom for EUKA-centret, definere et innovativt koncept og bevæge sig fra idé til teknologiudvikling med en målrettet indsats.

(Mere information om Afdeling for Svampebioteknologi på http://www.mucor.dk; en film, der viser det dimorfiske skift i Mucor, kan ses på adresse http://www.mucor.dk/funbio2.html).