Proteinstabilitet, vand og solutter
H2O. Ved første øjekast et meget simpelt
molekyle. Men på trods af mange års intensive studier
af dets egenskaber giver det stadig anledning til hovedbrud. Uden
vand, som bekendt intet liv; men hvad er det, der gør vand
så specielt? En af de unikke egenskaber ved vandmolekylet
er, at det både kan danne og modtage to hydrogenbindinger.
Denne egenskab kan virke triviel, men er faktisk årsag til
at livet, som vi kender det, eksisterer.
I biologiske systemer opretholdes proteiner og cellemembraner i
den aktive konformation gennem vekselvirkning med vand - både
struktur og funktion af makromolekylerne afhænger således
af, at der er vand tilstede. Biologisk aktivitet er en hårfin
balance, der bestemmes af vandets egenskaber - forholdsvis små
temperaturændringer vil medføre, at proteiner udfoldes
og derved mister deres funktion, og at cellemembraner overgår
til en biologisk inaktiv fase. Makromolekylernes stabilitet er afhængig
af solventets sammensætning, og derved vandets egenskaber.
Stabiliteten kan ændres ved at tilsætte salte eller
organisk forbindelser.
Organismer, der kan overleve ekstreme forhold som f.eks. meget
lave eller høje temperaturer, producerer visse små
organiske forbindelser i høje koncentrationer. Tilstedeværelsen
af de organiske forbindelser menes at være en medvirkende
årsag til, at disse organismer kan overleve situationer, der
for andre levende systemer vil medføre uoprettelige skader.
Undersøgelse af hvordan de organiske forbindelser, solutter,
påvirker vandet, og dermed makromolekylerne, vil give en generel
forståelse for, hvordan man ved tilsætning af solutter
til vand vil kunne påvirke stabilitet og opløselighed
af makromolekyler. Dette emne er vi en gruppe på Roskilde
Universitetscenter der arbejder på at belyse, -hovedsageligt
ved anvendelse af termodynamiske målemetoder.
Vand og makromolekyler
Interessen for emnet er opstået ud fra en forundring over,
at nogle dyr og planter kan overleve helt ekstreme forhold: det
kan være temperaturer langt under frysepunktet eller længere
tids tørke. Det har længe været kendt, at disse
organismer syntetiserer forskellige organiske forbindelser i høje
koncentrationer når de udsættes
for ekstreme påvirkninger. Det drejer sig bl.a. om en række
polyoler -heriblandt glycerol, sorbitol og trehalose, og om forskellige
frie aminosyrer [1]. Derfor er der naturligt opstået den tanke,
at disse forbindelser har en beskyttende effekt på proteiner
og cellemembraner, der medvirker til, at de ikke mister deres funktion.
Når vand bindes til overfladen af proteiner opnår proteinerne
en øget fleksibilitet, og denne fleksibilitet er afgørende
for aktiviteten [2]. Desuden vil den native struktur af et protein
opretholdes gennem vekselvirkning med vand. Vandbinding til overfladen
af cellemembraner bevirker ligeledes at membranerne fastholdes i
en fase, der muliggør, at membranproteinerne kan opretholde
deres aktivitet [3]. Hvis vandets egenskaber ændres, kan det
betyde, at proteinerne denatureres, eller får mindsket deres
aktivitet betydeligt, og at cellemembranerne gennemgår en
faseovergang - ændringer der vil være ødelæggende
for cellefunktionerne.
"Ændrede egenskaber": her kommer vandets mulighed
for at danne hydrogenbindingsnetværk ind i billedet. Normalt
beskrives stabiliteten af et foldet protein som en effekt af, at
proteinudfoldning vil medføre, at en lang række apolære
grupper, der normalt befinder sig i proteinets indre, bliver eksponeret
for vandet. De apolære grupper kan ikke indgå i hydrogenbindinger
med vand, og vandet kompenserer for de manglende muligheder for
vekselvirkninger med grupperne ved at danne indbyrdes hydrogenbindinger.
Vandmolekylerne danner således en velordnet struktur omkring
de apolære grupper. Dette vil skabe lavere entropi/større
orden, og derved en ikke-favorabel situation for systemet. Proteiner
vil ved fysiologiske temperaturer være foldet for at undgå
de ikke-favorable vekselvirkninger mellem vand og apolære
grupper - på den måde opnås den laveste energi.
Når temperaturen øges vil vandmolekylerne ikke i samme
grad kunne fastholdes i hydrogenbindingsnetværket omkring
de apolære grupper. Derfor vil det, ved en given temperatur,
være favorabelt for proteinet at udfoldes. Ved en temperatursænkning
vil det være andre ændringer i vandstrukturen der finder
sted, men også ved lave temperaturer er konsekvensen, at proteinerne
udfoldes [4].
Vandets egenskaber er altså af altafgørende betydning
for proteiners stabilitet, og tilsætning af solutter til en
opløsning vil, som temperatursvingninger, kunne ændre
disse egenskaber. Afhængig af typen af solut, vil det betyde
stabilisering eller destabilisering af proteiner. Dette lyder simpelt,
men hidtil er der ikke fundet nogen fyldestgørende systematik
i hvordan proteiner påvirkes, -man kan ikke umiddelbart afgøre,
hvilken effekt en given solut vil have på proteinstabiliteten.
Der er flere indgangsvinkler til denne problematik, der befinder
sig indenfor et område som populært kaldes biofysik
- hvor bl.a. termodynamik med fordel kan anvendes til beskrivelse
af biologiske systemer. Med udgangspunkt i vekselvirkninger mellem
proteiner og solutter i vandig opløsning vil jeg i det følgende
kort præsentere nogle af de termodynamiske målemetoder,
der kan anvendes til at opnå information om systemerne.
Ændringer i proteinopløselighed og stabilitet
Hvordan kan solutter påvirke opløseligheden og stabiliteten
af proteiner i vand?
 |
| Figur 1.: Cirklen illustrerer et protein.
Venstre: solutmolekylerne findes i højere koncentration
nær proteinoverfladen end i den øvrige opløsning,
medfører proteindestabilisering. Højre: solutmolekylerne
findes i lavere koncentration nær proteinoverfladen, medfører
proteinstabilisering. |
Effekten af solutterne på proteiners stabilitet kan beskrives
ud fra koncentrationen af solutten i nærheden af proteinet
relativt til i den resterende opløsning. Vandet i en proteinopløsning
kan opdeles i to faser: en i den umiddelbare nærhed af proteinet,
og en længere væk. Generelt gælder det, at solutter,
der er akkumuleret tæt på proteinet vil have en destabiliserende
effekt, mens solutter der er delvis ekskluderet fra proteinoverfladen
vil have en stabiliserende effekt [5]. De to situationer er illustreret
på figur 1. I tilfældet med akkumulering af solutter
nær overfladen drejer det sig ikke om decideret binding af
solutten til proteinoverfladen - nærmere at solutten "foretrækker"
området omkring proteinet frem for vandfasen.
Hvorvidt en solut foretrækker området omkring proteinet
afhænger af proteinets affinitet for hhv. vand og solut, og
dette afhænger endvidere af vandets affinitet for solutten.
Det er således en kompleks balance, der bestemmes af de enkelte
komponenters mulighed for at vekselvirke med hinanden.
Akkumulering af solutten nær proteinoverfladen kan opfattes
som et udtryk for favorable vekselvirkninger mellem solut og protein.
Grunden til
at akkumulering fører til destabilisering er, at udfoldning
af proteinet resulterer i, at overfladearealet af proteinet øges
betydeligt. Dette medfører øget mulighed for vekselvirkninger
med solutten: Favorable vekselvirkninger mellem solut og protein
vil generelt medføre en favorisering af den konformation
af makromolekylet, med størst overfladeareal. Da akkumulering
afspejler favorable vekselvirkninger mellem protein og solut, vil
man normalt observere, at proteiners opløselighed øges
i en opløsning med solutter, der sænker proteinstabiliteten
:
Favorable vekselvirkninger mellem protein og solut:
- akkumulering af solut nær proteinoverflade
- øget opløselighed
- mindsket stabilitet.
Ikke-favorable vekselvirkninger mellem protein og solut:
- eksklusion af solut nær proteinoverfladen
- mindsket opløselighed
- øget stabilitet
I organismer der kan overleve store temperaturudsving, ophobes
generelt solutter, der øger proteinstabiliteten, og dette
er sandsynligvis medvirkende til, at proteinerne ikke udfoldes under
temperaturpåvirkningerne. Udover solutternes indflydelse på
opløselighed og stabilitet, vil de påvirke aktiviteten
af proteinet. Som regel vil solutter, der stabiliserer proteiner
også bevirke en øget enzymaktivitet, og "valget"
af stabiliserende solut er derfor ikke ligegyldig, da en ændret
enzymaktivitet i levende organismer kan være problematisk
[1].
Metoder til bestemmelse af soluttens effekt på proteinstabiliteten
Hvorvidt en solut er akkumuleret eller ekskluderet fra proteinoverflader
kan undersøges ved osmometri , hvor man ved bestemmelse
af vands dugpunkt kan måle den effektive koncentration af
solutter i vand i en opløsning med og uden protein. Hvis
den effektive koncentration af solut er højere i proteinopløsningen,
vil det være et udtryk for at solutten er ekskluderet fra
proteinoverfladen, og derfor sandsynligvis har en stabiliserende
effekt på det native protein.
Den generelle effekt af en solut på proteiner kan undersøges
ved Differentiel Scannings Kalorimetri (DSC). Her vil udfoldningstemperaturen
af et protein kunne bestemmes med og uden solut i opløsningen.
En solut der medfører, at udfoldningstemperaturen stiger,
vil siges at have en stabiliserende effekt på proteinet. Ved
en mere omfattende undersøgelse vil man ud fra DSC målinger
kunne bestemme de forskellige termodynamiske størrelser som
funktion af temperaturen. Stabiliteten af det native protein beskrives
via Gibbs fri energi for udfoldning. En solut der har en stabiliserende
effekt på et protein, vil således øge Gibbs fri
energi for udfoldning, mens en destabiliserende solut vil sænke
Gibbs fri energi. Denne effekt er dog ikke nødvendigvis uafhængig
af temperaturen. I nogle tilfælde vil en solut stabilisere
proteinet ved høje temperaturer, men have en destabiliserende
effekt ved lave temperaturer, og netop DSC målingerne vil
kunne beskrive udviklingen. Ikke kun Gibbs fri energi for udfoldning
vil kunne bestemmes - også enthalpi og entropiændringer
vil kunne følges, og derved bidrage til en forståelse
af mekanismerne.
Solut-vand vekselvirkninger
Ud fra de to nævnte metoder kunne man have fået opfattelsen
af, at det er solutten og proteinets indbyrdes vekselvirkninger,
der afgør om der sker en eksklusion eller en akkumulering
af solutten nær proteinet. I virkeligheden findes nøglen
til forståelsen af vekselvirkningerne ofte i vandet - det
er i højere grad hhv. proteinets og soluttens vekselvirkninger
med vand der er afgørende for proteinstabiliteten. Grunden
til at en solut "foretrækker" at opholde sig nær
proteinoverfladen afspejler en balance mellem protein-vand, solut-vand
og solut-protein vekselvirkninger. Lidt firkantet kan man sige,
at
ikke-favorable vekselvirkninger mellem vand og solut øger
tendensen til at solutten befinder sig nær proteinoverfladen,
mens favorable vekselvirkninger mellem vand og solut øger
tendensen til eksklusion fra proteinoverfladen. Derfor ligger en
del af arbejdet i at forstå solutternes effekt på vand.
For at undersøge en soluts effekt på vandets egenskaber
kan man benytte sig af:
Damptryk: Damptrykket over en solutopløsning beskriver
hvor "glade" vandmolekylerne er for at opholde sig i vandfasen.
Favorable vekselvirkninger med solutten vil komme til udtryk ved
en sænkning af damptrykket. Et øget damptryk svarer
til at vandet har større tendens til at overgå til
gasfasen, og det kan henføres til ikke-favorable vekselvirkninger
med solutten.
Overfladespænding: beskriver hvor favorabelt det er
for solutten at opholde sig i overfladen frem for i den øvrige
opløsning. Solutter der øger overfladespændingen
i vandig opløsning vil findes i lavere koncentration nær
overfladen, og de samme solutter vil have tendens til at være
ekskluderet fra proteinoverflader. Omvendt forholder det sig med
solutter, der sænker overfladespændingen.
Isotermisk Titrerings Kalorimetri (ITC): beskriver de energetiske
vekselvirkninger mellem vand og solut, og giver herved information
om hvordan solutten påvirker det meget specielle hydrogenbindingsnetværk
i vand. Sammenholdt med damptryksmålingerne vil ændringer
i både enthalpi, entropi og Gibbs fri energi ved tilsætning
af solut kunne findes. Derigennem opnås viden om de mekanismer,
der enten øger eller mindsker soluttens tendens til at befinde
sig nær proteinoverfladen.
Biofysik er et område i hurtig udvikling, og de beskrevne
metoder begrænser sig naturligvis ikke til undersøgelse
af solut-protein vekselvirkninger. ITC har vist sig at være
en meget velegnet metode til studier af bl.a. ligandbinding til
proteiner. Desuden kan både kalorimetri og damptryksmålinger
anvendes på tørre proteiner og membraner, -eksempelvis
ved undersøgelse af vandbinding.
De beskrevne undersøgelser kan bidrage til forståelse
af, hvad der gør nogle organiske forbindelser mere velegnede
end andre til beskyttelse af cellefunktionerne. Naturligvis kan
undersøgelserne ikke opklare de kulde- og tørketolerante
organismers "valg" af solutter, da mange andre faktorer
også spiller ind, men de kan give en idé om, hvorfor
én solut er at foretrække frem for en anden.
Emnet er ikke kun interessant for at forstå overlevelsesmekanismerne
hos kulde- og tørketolerante organismer - på sigt vil
det være medvirkende til, at man vil blive i stand til at
fremstille optimale opløsningsmidler, f.eks. for at øge
den termiske stabilitet eller for at ændre opløselighed
og aktivitet af et protein.
Referencer:
1. P. Hochacka & G. Somero: Biochemical Adaptions. Princeton
University Press, Princeton, 1984.
2. P.A. Fields. Comparative Biochemistry and Physiology A -
Molecular and Integrative Physiology, 129(2-3): 417-431, 2001
3. K. Storey & J. Storey. Physiological Reviews, 68,
27-84, 1988
4. G. Graziano, F. Catanzano, A. Riccio, G. Barone. Journal
of Biochemistry, 122(2), 395-401, 1997
5. S. Timasheff. Advances in Protein Chemistry, 51, 355-432,
1998
|
