|
Bioteknologi har fundet anvendelse i århundreder til fremstilling
af øl, vin, ost, og brød. Under den 2. verdenskrig blev der udviklet
storskala produktion af penicillin, der var den første bioteknologiske
produktionsproces til fremstilling af et lægmiddel. Efter krigen
førte dette til udbredelse af gæringsprocesser til fremstilling
af en lang række forskellige antibiotika. I denne periode blev der
hele tiden udviklet nye stammer af produktionsorganismerne der gav
højere udbytter, og forbedringer af Penicillium chrysogenum,
der anvendes til penicillinproduktion, har ført til mere end en
faktor 10.000 forøgelse i penicillinudbyttet. Disse forbedringer
blev opnået ved klassisk stammeudvikling der involverede mutagenisering
og screening. Klassisk stammeudvikling har tydeligvis været meget
succesfyldt, men metoden er dog også meget arbejdskrævende og den
er ikke specielt målrettet. Herudover opstår der i mange tilfælde
uhensigtsmæssige mutationer der f.eks. giver forandrede egenskaber
af produktionsorganismen.
Med Cohen og Boyer’s introduktion af gensplejsning
af Escherichia coli i 1973 blev der åbnet op for en ny måde
for forbedring af gæringsprocesser og til udvikling af helt nye
bioteknologiske processer. Dette førte hurtigt til introduktion
af en række nye processer til fremstilling af farmaceutiske proteiner
ved anvendelse af gensplejset E. coli. Sådanne proteiner,
f.eks. insulin og human væksthormon, var tidligere blevet produceret
ved ekstration fra dyrevæv men med produktion vhj. af gensplejsede
mikroorganismer blev der åbnet op for en mere reproducerbar produktionsmetode
samt en metode der forhindrede overførsel af f.eks. virus fra dyrevævet
til patienter. Anvendelse af gensplejsning har ført til udvikling
af produktionsprocesser for en lang række proteiner, og i dag produceres
der mere end 55 proteiner der finder anvendelse som lægemidler ved
hjælp af gæringsprocesser. Dette repræsenterer et verdensmarked
på mere end 20 milliarder US$, og markedet for rekombinante proteiner
er i stærk vækst. Til produktion af rekombinante proteiner anvendes
ikke kun mikroorganismer men også højere eukaryoter såsom hybridoma
celler, CHO celler (chinese hamster ovary celler), insektceller
etc. Valg af produktiossystem afhænger af en række faktorer
såsom evnen til at foretage komplekse glykosyleringer, stabilitet
af det producerede protein, og kravet til volumen af produktet.
Således produceres et simpelt ikke-glykosyleret protein som insulin
i E. coli og i bagegæren Saccharomyces cerevisiae,
idet disse organismer giver mulighed for opnåelse af høje produktiviteter,
mens mere komplekse glykosylerede proteiner som tPA (tissue plasminogen
activator) og erythropoeitin produceres i mammale celler (ofte CHO
celler).
Introduktion af gensplejsning har også ført til muligheden
for anvendelse af en mere målrettet forbedring af produktionstammer
der anvendes til fremstilling af klassiske bioteknologiske produkter,
såsom antibiotika, sprit, mælkesyre etc. Via introduktion
af specifikke genetiske ændriger er det således muligt at omdirigere
kulstofsstrømmene i cellerne, og hermed dirigere mere kulstof fra
substratet (råvaren) til det endelige produkt. Samtidig kan uønskede
pathways fjernes, og dannelse af biprodukter kan hermed elimineres
eller reduceres. Anvendelse af gensplejsning til forbedring af produktionsstammer
er blevet betegnet metabolic engineering, og denne strategi
anvendes i dag til forbedring af en lang række "klassiske"
fermenteringsprocesser til fremstilling af produkter som antibiotika
(penicillin, cephalosporiner, erythromycin, nystatin, vancomycin
etc.), primære metabolitter (ethanol, citronsyre, mælkesyre,
lysin, glutamat, phenylalanin etc.), polymere (xanthan gum,
alginat, polyhydroxybutyrater etc.), og industrielle enzymer
(chymosin, detergent enzymer, bageenzymer etc.). Den totale
markedsværdi af disse produkter overstiger 45 milliarder US$, og
der er en kraftig vækst i markedet. Således er flere stor kemikoncerner
ved at etablere nye bioteknologiske processer. Et joint veture imellem
Cargil og Dow Chemicals vil ved etablering af en ny fabrik fordoble
verdens produktionen af mælkesyre, med henblik på at producere polylaktat
der er en attraktiv ny polymer (polylaktat har gode egenskaber som
plastmateriale og er samtidig bionedbrydelig). En anden stor amerikansk
kemikoncern er ved, at etablere en produktion af 1,3 propandiol,
der kan finde anvendelse som udgangsstof for syntese af en række
forskellige produkter. I de fleste af disse processer er der foretaget
en række genetiske ændringer i produktionsstammerne, og i flere
tilfælde er der rekruteret enzymer fra andre organismer med henblik
på etablering af helt nye pathways.
Succesfyldt anvendelse af metabolic engineering kræver
en detaljeret analyse af cellernes metabolisme for at identificere
hvilke genetiske ændringer der skal introduceres og for at evaluere
konsekvenserne af introducerede mutationer. Hertil er der udviklet
nye metoder, hvor matematiske modeller for cellens metabolske netværk
kombineres med målinger af strømme ind og ud af cellen muligør beregning
af kulstofstrømmene (eller fluxene) igennem de forskellige grene
af det metabolske netværk. Således kan aktiviteten af de forskellige
pathways kortlægges, og dette kan give værdifuld information hvis
forskellige mutanter sammenlignes, f.eks. sammenligning af en vild-type
stamme og en stamme hvor et specifikt gen er deleteret. I denne
analyse af cellerne er det vigtigt der foretages en system betragtning,
dvs. hele cellens metabolske og regulatoriske netværk betragtes.
Dette er vigtigt idet over-udtrykkelse af et bestemt gen ofte ikke
har den ønskede effekt fordi regulatoriske netværk i cellen fører
til en nedregulering af andre gener der også spiller en vigtig rolle.
Anvendelse af en system-betragtning er derfor afgørende for succes
i metabolic engineering, og der er derfor en klar interaktion med
funktional genomics som diskuteret mere i det følgende.
Inden for de senere år er der sket en revolution inden
for biologien. Denne revolution er hovedsagelig drevet af det faktum,
at genomerne af en række organismer er blevet fuldstændig sekventeret.
På nuværende tidspunkt er genomet af mere end 50 mikroorganismer
sekventeret, inklusiv flere sygdomsfremkaldende bakterier såsom
Haemophilus influenzae (meningitis), Mycoplasma pneumonia
(lungebetændelse) samt mange industrielt vigtige organismer såsom
Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis og Escherichia
coli. For de fleste genomer, der er sekventeret, har kun omtrent
60% af generne en kendt funktion, og dette har resulteret i en række
initiativer til at tilskrive gener med ukendt funktion en given
funktion i cellen – et forskningsområde der normalt referes til
som functional genomics. Forskning inden for functional genomics
repræsenterer et paragdigmeskift i biologisk forskning, idet
man traditionelt har arbejdet ud fra en given funktion og herefter
har identificeret det tilhørende gen, hvorimod adgang til information
om hele genomet har ført til en system betragtning af cellers funktion.
Functional genomics betegnes derfor også ofte som systems biology,
og udfra ovenstående diskussion er det klart der er et stort interessefælleskab
med metabolic engineering.
I functional genomics arbejdes der ofte med karakterisering
af mutanter hvori de enkelte gener er deleteret. Således er der
igennem et stort EU-financieret forskningsprojekt (EUROFAN), som
kører i samarbejde med amerikanske, canadiske og japanske universiteter
konstrueret et stort antal mutanter af bagegæren S. cerevisiae,
hvor hver enkelt mutant er karakteriseret ved at et specifikt gen
er blevet deleteret. Målet er herefter at identificere en eventuel
fænotype for hver enkel af disse mutanter. Et problem i forbindelse
med dette projekt er imidlertid, at der er stor grad af redundans
i de sekventerede gener, dvs. mange gener har redundant funktion,
og deletion af en lang række gener resulterer ikke i en mutant med
en bestemt fænotype. Med udvikling af en række nye eksperimentelle
teknikker vil det dog være muligt at anvende en mere holistisk (eller
system baseret) angrebsvinkel. Disse eksperimentelle teknikker muliggør
analyse på forskellige niveauer i det centrale dogme i biologien
(fra gen til mRNA og videre til protein). Blandt disse teknikker
kan nævnes:
DNA chips (eller DNA arrays). Med DNA chips er
muligt at måle et meget stort antal mRNA, endda måle transkription
af samtlige gener i et genom. Teknikken er baseret på, at oligonukleotider
fikseres i en meget høj koncentration på enten et filter eller en
chip. Oligonucleotider kan enten være baseret på RNA eller DNA.
For analyse ekstraheres mRNA fra en celle, og der foretages en revers
transkription af alle mRNA der er tilstede i prøven. Dette fører
til dannelse af cDNA der kan probes direkte til DNA baserede oligonucleotider
på chippen. Alternativt kan cDNA omdannes videre til cRNA, der kan
hybridisere til ribonucelotider fikseret på chippen. Ved inkorporering
af fluoroscerende nucleotider i det syntetiserede cDNA eller cRNA
kan hybridiseringen af de enkelte nukleotid-fragmenter kvantificeres
vhj. af en fluorscens scanner. Det er muligt at anvende en høj densistet
af prober på chippen, og det er således muligt at måle ekspression
af samtlige 6.000 gener i S. cerevisiae ved anvendelse af
én chip med et overfladeareal på 1 cm2.
Proteomics, der omfatter metoder til analyse
af den samlede protein pool i cellerne. Ved hjælp af 2D-gelelektroforese,
hvor proteiner adskilles både efter størrelse og ladning er det
muligt at måle et stor antal proteiner på samme tid. Ved kombination
af denne teknik med massespektrometri er det muligt at identificere
de enkelte proteiner på gelen, samt endvidere fastlægge hvorvidt
proteinerne er phosphoryleret eller ej.
Metabolite profiling, hvor et stort antal metabolitter
dannet i cellerne måles. Metabolit profilen i cellerne repræsenterer
en unik fenotypisk karakterisering, og metabolit niveauerne er et
resultat af genekspression, proteinsyntese, proteinaktivering og
in vivo aktiviteten af de enkelte enzymer. Ved hjælp af GC-MS
og LC-MS er det muligt at måle et meget stort antal metabolitter
med en analyse (ved Center for Bioteknologsik Procesforskning arbejder
vi med en GC-MS metode der kan analysere mere end 60 metabolitter).
Ved kombination af metabolitanalyser og metabolske modeller er det
muligt at identificere specifikke mutationer, og endda i nogle tilfælde
tilskrive funktion af gener med ukendt funktion.
Generelt for disse teknikker er, at de giver information
om interaktionen imellem mange forskellige pathways i cellen, og
derfor giver information om hele systemet i cellen. De er derfor
centrale eksperimentelle metoder i systems biology. Metoderne giver
dog også et meget stort antal data, og det er afgørende for succes
i anvendelse af disse teknikker at der anvendes bioinformatik.
Der findes en række tilgængelige bioinformatiske metoder til behandling
af denne type data, men ofte er det værdifuldt at udvikle nye metoder,
f.eks. hvor DNA chip data knyttes sammen med studier af promoter
strukturer, i forbindelse med behandling af de eksprementelle data.
Moderne bioinformatik spiller derfor en helt central rolle i systems
biologi.
De ovenfor beskrevne eksperimentelle metoder finder
bred anvendelse indenfor basale studier af cellefunktion. Således
anvendes DNA chips og proteomics i stor udstrækning til studier
af de grundlæggende mekanismer bag en række sygdomme. Som ovenfor
beskrevet er det dog også klart, at disse metoder er meget værdifulde
i studier af bioteknologiske processer. Dette illustrerer den tendens
der i øjeblikket er indenfor forskning – en tæt interaktion imellem
grundforskning i studier af mekanismer og anvendt forskning. Metoder
udviklet indenfor det ene felt kan finde anvendelse i det andet
felt, og opdagelser i grundforskning omsættes i dag hurtigt til
konkrete anvendelser.
Ved etablering af BioCentrum-DTU den 1. januar 2001,
blev der skabt en ny sektion ved DTU der har en stor forskningsaktivitet
indenfor systems biology. Denne sektion betstår af to store forskningscentre:
Center for Bioteknologisk Procesforskning (CBP) og Center for Biologisk
Sekvensanalyse (CBS). Sektionen har mere end 75 medarbejdere med
omtrent 15 post docs og 35 Ph.D. studerende. CBP har en stor forskningsaktivitet
indenfor metabolic engineering, og har i den forbindelse etableret
teknikker til metabolite profiling og anvender DNA chips til karakterisering
af forskellige mikroorganismer. CBS er den førende bioinformatikgruppe
i Danmark, og gruppen har en stor aktivitet indenfor udvikling af
metoder til fortolkning af data fra DNA chips, samt anvendelse af
DNA chips til analyse af humane celler. Der en tæt interaktion imellem
forskningsaktiviteterne i de to forskningscentre, der begge indgår
i Danmarks Bioteknologiske Instrument Center. Igennem samarbejde
vil de to centre styrke aktiviteterne indenfor systems biology ved
DTU og udvikle nye metoder der kan finde anvendelse indenfor functional
genomics og bioteknologisk procesforskning.
|
