|
Hvem kender i dag ikke ordet DNA? Men man skal ikke mange år tilbage
før ordet DNA kun var kendt af fagfolk, og begrebet eksisterede
ikke blot vi går 40 år tilbage i tiden. Watson og Crick (1) var
i 1953 de første der beskrevDNA og dens dobbeltstreng. I 1960¹erne
var Khorana og medarbejdere (2) de første til syntetisk at fremstille
en kort streng DNA.
Det åbnede en helt ny verden. I Danmark interesserede institutleder
Kaj Brunfeldt fra Protein Kemisk Laboratorium i Forskningscentret
ved Hørsholm sig ret tidligt for DNA synteserne. Kaj Brunfeldt
havde to medarbejdere civ. ing. Keld Norris og civ.ing. Thorkild
Christensen, som begge i henholdsvis 1978 og 1981 blev sendt til
USA for at lære at synthetisere stykker af DNA. Keld Norris var
hos Prof. Khorana (3). Det lykkedes dem begge i løbet af 1/2 år
at fremstille et stykke DNA, der var 3 -10 baser lange. På det tidspunkt
fandtes der ingen maskiner som kunne syntetisere DNA og alt blev
fremstillet i kolber med håndkraft.
På samme tidspunkt drev civ.ing. Niels Clauson-Kaas sit private
forskningslaboratorium i Farum med 10 kemikere. Niels Clauson-Kaas
var kendt for i en menneskealder at være en af de førende kemikere
i Danmark og Kaj Brunfeldt foreslog omkring 1980 at Niels Clauson-Kaas
skulle begynde fremstillingen af de specielle byggestene som DNA
består af: deoxyAdenosin (dA), deoxyCytidin (dC), deoxyGuanosin
(dG) og Tymidin (T), tilsammen i korthed deoxynucleic acid (DNA).
Niels Clauson-Kaas kom aldrig i gang med dette projekt, da det
blev overhalet af de hurtige amerikanere. 1981 og 1983 blev mærkeår,
da Caruthers og medarbejdere (4) publiserede metoder til fremstilling
af DNA stykker. Deres metode bestod i at byggestenene blev omdannet
til derivater, der var stabile og kunne anvendes til automatiserede
fremstillinger af kunstig DNA. Keld Norris var på hjemlig front
med i dette stykke pionerarbejde og var en af de første i verden
der anvendte fastfasesyntese af DNA.
I begyndelsen af 1980¹erne fandt prof. Herbert Köster på en modificeret
udgave af DNA syntesen (5), som bestod i at gøre byggestenene, de
såkaldte phosphoramiditter, mere stabile og reaktionsdygtige, og
denne metode anvendes iøvrigt stadig. Applied Biosystem Inc. (ABI)
købte licenserne til fremstilling af kemikalierne, som skulle bruges
til synteserne, samtidig med at den første kommercielle automatiske
DNA syntesemaskine (ABI 380, eenstrenget maskine) blev lanceret
i 1985. Mens ABI startede fremstilling af phosphoramiditter i Californien
startede prof. Köster sin fabrik i Hamburg (Biosyntech). Begge firmaer
fremstillede alle de kemikalier og reagenser som skulle bruges til
DNA syntesen. Prof. Köster gik senere i samarbejde med Milligen
og Biosearch, som i midten af 1980¹erne lancerede deres versioner
af DNA syntesemaskiner: Biosearch 8700 og lidt senere deres Expedite.
Lektor Otto Dahl på Kemisk Laboratorium 2, KU, havde i flere år
arbejdet med phosphorkemi, og det var naturligt for ham at gå i
gang med DNA syntesen, da kemien i fremstilling af DNA i høj grad
er baseret på phosphorkemi. Otto Dahl fik i 1984 bevilliget sin
første DNA syntesemaskine af mærket Nucsyn. Den blev dog hurtigt
efterfulgt af en ny og større model af typen Biosearch 8700, en
yderst pålidelig firestrengs maskine, som stadig er i daglig anvendelse
på Kemisk Laboratorium 2. Keld Norris var i mellemtiden flyttet
til Novo A/S, Bagsværd, og fik sin første ABI 380 maskine i 1985,
og Thorkild Christensen var flyttet til Nordisk Gentofte A/S, Gentofte.
Begge virksomheder ønskede på det tidspunkt at kunne fremstille
humant Insulin ved hjælp af gensplejsning og dertil skulle man anvende
den nye teknologi med fremstilling af kunstigt DNA populært kaldet
en oligo, som dækker betegnelserne for primere og prober.
Afsættet
Nu tog tingene fart. Carlsberg Forskningscenter fik i 1985 sin
egen maskine. De ville forske i gærs genom. Desuden blev der i hurtig
rækkefølge installeret DNA syntese maskiner af mærket ABI hos Københavns
Universitets afdeling på Ø. Farimagsgade, Institut for Medicinsk
Biokemi og Genetic, Institut for Populationsbiologi, Patologisk-Anatomisk
Institut, Århus Universitet, Bioteknologisk Institut (Milligen Instrument),
Lyngby, Landbohøjskolen (Milligen Instrument), Frb., Institut for
Mikrobiologi, DTU, Lyngby, Rigshospitalet, Kbh., Kræftens Bekæmpelse,
Kbh., Dako, Glostrup, Danisco, Kbh., Statens Serum Institut, Kbh.,
Odense Universitet (Pharmacia instrument). Flere afdelinger på det
senere Novo Nordisk A/S, Bagsværd, anskaffede sig selvfølgelig også
DNA syntesemaskiner.
Maskinerne udviklede sig fra midten af 1980'erne til 1991, hvor
den populære ABI 394 blev introduceret. Det var en 4 strengs maskine,
der på det tidspunkt dækkede alles behov for oligoer. Den kunne
lave små mængder (40 nmol skala) op til større mængder (10 mikromol
skala). Den var fuldt automatiseret, idet man fra sin Mac computer
kunne sende de ønskede sekvenser over, vælge skala, osv., trykke
på startknappen og efter 2-3 timer var 4 oligoer af almindelig længde
syntetiserede. Man kunne rutinemæssigt fremstille op til 12 oligoer
om dagen.
 |
|
DNA syntesemaskiner i et moderne DNA
synteselaboratorium.
|
|
Kemien
Opbygningen af DNA-molekylet foretages på DNA syntesemaskinen i
en lille kolonne. Kolonnen er fyldt med passende mængde af det første
nukleosid bundet til en fastfase, som kan være en polystyren overflade
eller såkaldt CPG (controlled pore glass). På maskinen tilsluttes
i opløsning de fire byggestene (phospho-ramiditter), også kaldet
henholdsvis dA amidit, dC amidit, dG amidit og T amidit, samt de
5 hjælpereagenser: Tetrazolopløsning, Cap A og Cap B opløsninger,
iodopløsning, trikloreddike-syreopløsning samt acetonitril, som
anvendes som skyllemiddel. Inde i maskinen findes en serie ventiler,
som styres af en computer. Man indkoder den ønskede sekvens i computeren
eller, som nu om dage, man sender sekvensen direkte over fra en
database, påsætter kolonnen med den rigtige startnukleosid og trykker
på startknappen. Via et indbygget program styres åbning og lukning
af ventilerne således at reagenser og solventer bliver ledt gennem
kollonnen i den ønskede rækkefølge.
Opbygningen af et DNA-molekyle med de beskrevne reagenser foregår
som vist på fig. 1. Koblingen mellem det første nukleosid siddende
på fastfasen og det næste i rækken katalyseres af tetrazol. Der
dannes en phosphit-bro i stedet for den ønskede phosphat-bro, så
en oxidation er nødvendig, hvilket sker med iod/vand. Da reaktionen
”kun” går i omkring 99% udbytte skal den sidste ene procent gøres
inaktiv med capping reagenserne (en acetylering af ureageret OH-gruppe).
Efter capping og oxidation fraspaltes beskyttelsesgruppen DMT (dimethoxytrityl-gruppen)
ved hjælp af trikloreddikesyre opløst i diklormetan og derved frigøres
en fri OH gruppe, og det hele starter forfra med kobling til det
tredie nukleosid i rækken. Rækken af syntesentrin udgør sammen med
vasketrin en reaktionscyclus og forløber i et samlet udbytte på
98-99%, hvilket stiller høje krav til renhed af kemikalier og reagenser.
Syntesen starter altid fra 3¹-enden.
KJ Ross-Petersen AS
Omkring 1990 var problemet for mange molekylær biologer at prisen
for primere og prober på gr. af kemikaliepriserne var skyhøj. Prisen
på de fire byggestene samt de 5 hjælpereagenser var så høj at een
kobling kostede ca. 20 kr. i rene kemikalieomkostninger. Phosphoramiditerne
kostede da prisen var højest ca. 1.800 kr. per gram. I dag er prisen
under en tiende del.
Undertegnede havde siden marts1984 drevet firmaet KJ Ross-Petersen
AS som selvstændig forskningslaboratorium i Forskningscentret ved
Hørsholm og havde i 1988 behov for en mindre produktion af mere
kostbare stoffer. Otto Dahl gav mig ideen til at fremstille phospho-ramiditterne
i mit laboratorium og efter 1 års forskning i laboratoriet og med
stor støtte fra Otto Dahl blev de første gram syntetiseret i Hørsholm
samtidig med at de første flasker af hjælpekemikalerne blev fremstillet.
Det hele blev påfyldt og solgt med egne etiketter og i flasker som
direkte kunne påsættes de forskellige DNA syntesemaskiner.
Carlsbergs Forskningslaboratorium var undertegnedes første kunde,
men kort tid efter kom stort set alle andre danske brugere i kundekartoteket.
To ting gjorde udfaldet: Kvaliteten af kemikalierne var i top og
prisen blev sat som i USA og England, hvor priserne var ca. det
halve af hvad den danske ABI agent forlangte. Den lave pris var
især attraktivt for universiteterne med deres altid begrænsede budgetter.
Custom DNA syntesis
Da Otto Dahl var den første som i offentligt regi fremstillede
oligoer i forbindelse med sin forskning kom flere og flere til ham
for at få ham til at levere en oligo eller to og dermed opstod i
virkeligheden i Danmark det første custom DNA synteselaboratorium.
Det skal dog nævnes at det ikke blev drevet kommercielt. Otto Dahl
solgte ikke oligoerne, men fremstillede dem som en service. På samme
måde opererede Århus Universitet omkring 1990, da de fik bevilliget
deres maskine. Bioteknologisk Institut i Lyngby med læge Claus Christiansen
som institutleder (senere Danisco) fik i 1988 startet forretningsområdet
³salg af oligoer². De havde anskaffet sig en 2 strengs Milligen
maskine og ved siden af deres eget forbrug af oligoer solgte de
custom made oligoer for 35 kr. per base. Læge Poul Andersson var
ansvarlig for produktionen, og han blev hurtigt klar over, at for
at det skulle blive et rentabelt forretningområde skulle Bioteknologisk
Institut fremstille over 2000 oligoer per år. Det kunne de ikke
med den daværende instrumentering og de stoppede derfor egenproduktionen.
I 1993 etablerede cand. scient. Sten Lovmand og undertegnede Danmarks
første rene Custom DNA synteselaboratorium DNA Technology A/S. Sten
Lovmand stod på det tidspunkt for produktionen af oligoer på Århus
Universitet og havde lyst til at være selvstændig. Han foreslog
et samarbejde med undertegnede, som havde alle kemikalierne, og
vi lejede lokaler i Forskerparken i Århus, og med Århus Universitet
som første kunde var virksomheden i gang. Undertegnede fik hurtigt
flere af sine kunder i Københavnsområdet til enten at skifte fra
en udenlands leverandør eller fra en urentabel egenproduktion til
at købe oligoer i Århus. Priserne per base var ca. 12 kr og opefter.
Men efter en succesrig periode opstod diskussionen om de fremtidige
forretningsområder og efter 3 års samarbejde forlod undertegnede
virksomheden i foråret 1996.
Masseproduktion af DNA
I 1996 startede cand. polit. Jakob Ross-Petersen virksomheden TAG
Copenhagen. Filosofien bag TAG Copenhagen var at markedet ville
fortsætte med at vokse eksplosivt og at der derfor var behov for
etablering af en produktion baseret på helt nye principper og rutiner.
Virksomheden blev organiseret således at den kunne håndtere et produktionsniveau
der var op til 10 gange så stort som det komplette danske marked
i 1996.
Det har siden vist sig at være en rigtig strategi. TAG Copenhagen
er idag nået op på et produktions niveau langt over det samlede
oligo marked i 1996 og priserne er med den nye produktionsteknologi
og den nye organisering kommet helt ned i 3 kr. per base.
TAG Copenhagens succes har givet genlyd ude i verden og virksomheden
har nu eksporteret sit koncept til flere DNA synteselaboratorier
i lande uden for Skandinavien.
Microarray biochip teknologien I disse år forskes der overalt på
fremstilling af Microarray biochips, hvor tusinder af oligoer eller
DNA fragmenter fremstillet ved hjælp af PCR teknik, bliver sat på
en glas- eller plastoverflade. Der kan typisk påsættes 5 - 10.000
forskellige DNA stykker på et areal mindre end 1 cm2. Chipsenes
fremtid ligger i at de kan anvendes til bl.a. screening af blod,
hvor man søger efter bestemte gener. Der ligger store udfordringer
for oligohusene, når de pludselig skal fremstille f. eks. 5000 forskellige
oligoer til påhæftning på chips. Her forventes især TAG Copenhagen
at komme med i front på grund af sin avancerede fremstillingsteknologi
til masseproduktion af DNA.
Referencer:
- J.D. Watson og F.H.C. Crick, Nature 171 (1953) 737.
- H.G. Khorana, Pure Appl. Chem. 17 (1968) 349.
- K. Norris, Dansk Kemi 53 (1972) 107, K. Brunfeldt, Dansk Kemi
65 (1984) 324.
- S.L. Beaucage og M.H. Caruthers, Tetr. Lett. 24 (1983) 245,
L.J. Mc.Bride og M.H. Caruthers, Tetr. Lett. 24 (1983) 245.
- H. Köster and N. Sinha, Biosyntech, Hamburg, Eur. 0152 459.
|
