|
I oktober 1997 overrakte Kong Carl XVI Gustaf for Det Kongelige
Svenske Videnskabernes Akademi, Nobel Prisen i Kemi for 1997 med
en halvdel til Jens C. Skou for den første opdagelse af et
jon transporterende enzym, Na,K-ATPase (1-2). Den anden halvdel
delte Paul D. Boyer, University of California, Los Angeles og John
E. Walker, Cambridge, England for deres opklaring af den enzymatiske
mekanisme bag syntesen af ATP.
Skou’s opdagelse af Na,K-ATPase
Skou tog medicinsk eksamen i København i 1944 og havde
som ung læge planer om at blive kirurg. Han var ansat på
Hjørring sygehus 1944-46, men fik i 1947 en stilling som
amanuensis på Fysiologisk Institut ved Aarhus Universitet
hvor han begyndte at arbejde med en problemstilling han havde medbragt
fra kirurgisk afdeling, mekanismen bag virkningen af lokalanæstetika.
Det blev til en monografi "Lokalanæstetika", som
Skou forsvarede for den medicinske doktorgrad i 1954, og en serie
artikler i farmakologiske og fysiologiske tidsskrifter.
 |
|
Figur 1. ATPase aktivitet som funktion
af koncentrationen a K+ i tilstedeværelse af 6 mM Mg2+
og forskellige koncentrationer af Na+. Enzymreaktionen igangsættes
ved tilsætning af 100 :l suspension af nercvemembraner
fra krabber til 0.9 ml medium med 3 mM ATP, 6 mM MgCl2, KCl
og NaCl som angivet og 30 mM histidin, pH 7,2. Efter 15 min
ved 36oC stoppes reaktionen med 0,1 ml 50% trikloreddikesyer.
Prøven centrifugeres, og uorganisk fosfat måles
i spektrofotometer efter reduktion af komplekset med molybdat.
Gengivelse af Figur 5 i reference 1.
|
I 1953 studerede Skou effekten af lokalanæstetika på
overfladetrykket i monomolekylære lag af nervelipider, der
var spredt ud på vandflader i Langmuir trug. Han fandt at
lokalanæstetika i lipidfasen øgede overfladetrykket
og at stigningen i tryk var korreleret til stoffernes anæstetiske
virkning. Han rejste spørgsmålet, om denne stigning
i overfladetryk har indflydelse på strukturen af Na+ kanaler
i nervemembranen og således kan forklare den anæstetiske
effekt. For at stabilisere enzymaktiviteter i lipidfasen søgte
Skou efter lipoproteiner med enzym aktivitet. Under et ophold i
1954 på den marinbiologiske forskningsstation i Woods Hole
nær Boston blev Skou opmærksom på beskrivelser
af en Mg-ATPase i membraner fra kæmpe axoner fra blæksprutter.
Skou havde ikke adgang til blæksprutter, men tilbage i Aarhus
fandt han en Mg-ATPase i membran fraktioner fra krabbe nerver. ATPase
aktiviteten varierede fra præparat til præparat uden
en rimelig forklaring. Han fjernede Na+ og K+ holdige buffere fra
medierne og fandt efter flere måneders forsøg med systematisk
søgning at Na+ øgede ATPase akviteten når han
brugte K+ salt af ATP, men ikke når han brugte Na+-ATP, d.v.s.
at aktiviteten var afhængig af Na+ plus K+. Skou kunne gennemføre
en detaljeret analyse af Na,K-ATPase aktiviteten i nervemembraner.
Den blev publiceret i 1957 i Biochimica et Biophysica Acta (1).
Som eksempel på resultaterne viser Figur 1 den oprindelige
Fig. 5 af de ialt 11 figurer i artiklen. Det ses at der er tale
om meget nøjagtige målinger. Den vandrette kurve viser
at der ikke er ATPase aktivitet med K+ alene i mediet. I tilstedeværelse
af Na+ i mediet stiger ATPase aktiviteten når K+ tilsættes
indtil den når et maksimum, der afhænger af koncentrationen
af Na+, og højere koncentrationer af K+ hæmmer aktiviteten.
Fordi krabben lever ved høje saltkoncentrationer er de optimale
koncentrationer højere end hos pattedyr. Senere fandt Skou
at ouabain (digitalis) hæmmer aktiviteten af Na,K-ATPase i
nervemembraner. Valget af krabbe nerverne var meget heldigt, idet
senere eksperimenter har vist, at det er et af de få væv
hvor Na,K-ATPase aktiviteten er eksponeret uden brug af detergenter.
Dog var det et problem, at Skou måtte præparere ca.
25.000 nerver for at få væv nok. For at slå krabberne
ihjel blev de kogt i vand og lugten bredte sig over hele institutet.
Skou fortsatte med analyser af Na,K-ATPase aktiviteterne i hjerne
og nyre. I andre laboratorier blev det vist at Na,K-ATPase findes
i alle væv og celler, hvor der kan påvises aktiv Na,K-transport
over cellemembranen, og at aktiviteten af enzymet er proportional
med kapaciteten for aktiv Na,K-transport. Udfra disse og andre forsøg
kunne Skou vise at systemet opfylder en række kriterier, som
må opfyldes for at etablere en forbindelse mellem den enzymatiske
aktivitet og aktiv transport af Na+ K+ over cellemembranen (2).
 |
|
Jens C. Skou modtager sin Nobel pris af Hans
Majestæt Kong Carl XVI Gustaf i Stockholms Konserthus
den 10. december 1997.
|
Perspektiverne i Skou’s opdagelse
Skou’s biokemiske definition af Na,K-ATPase etablerede en direkte
kobling af ATP spaltning til Na,K-transport over membranen. Na,K-pumpen
var således identificeret som et enzym og et protein. Herved
havde han skabt grundlaget for en række nye undersøgelser
af pumpens struktur og mekanisme. Studiet af de enzymatiske aspekter
af den aktive transport betød også et fagligt skift,
fra traditionelle fysiologiske undersøgelser på celler
og væv til biokemiske analyser på isolerede membraner
og proteiner. Ved definitionen af Na,K-ATPase havde Skou etableret
det nødvendige værktøj for renfremstilling og
karakteristik af pumpens protein. Den vigtigste betingelse for oprensning
er et godt assay, der giver et mål for mængden af det
specifikke protein i et givet præparat. Her var måling
af Na,K-ATPase aktiviteten eller binding af ouabain ideelle, men
selv om betingelserne var til stede, var det først mere end
10 år senere, i 1969-1973, at forsøgene på renfremstilling
af Na,K-ATPase begyndte at lykkes (3).
Et eksperimentelt bevis for at Na,K-ATPase er identisk med Na,K-pumpen
i cellemembranen kom i 1971, da S. Goldin og L. Hokin kunne indbygge
Na,K-ATPase i fosfolipid vesikler og demonstrere aktiv Na+ og K+
transport over vesiklernes membran ved tilsætning af ATP.
Før Skou’s opdagelse var Na-pumpen karakteriseret i frøskind
ved Ussing’s målinger på frøskind og ved flux
målinger med isotoper i intakte celler, især i nerver
og røde blodlegemer. Så tidligt som 1902 gjorde Overton
opmærksom på at hjertes og musklernes kontraktioner
må medføre at noget Na+ må transporteres ind
i cellen og noget K+ ud af cellen for hver kontraktion og at der
må være en mekanisme som modvirker denne udligning.
Ørskov viste i 1934 at røde blodlegemer fra duer taber
K+ når de udsættes for bly og at de optager K+ ved aktiv
transport når blyet fjernes. Ørskov fandt også
at optagelsen af K+ i røde blodlegemer fra fugle kan stimuleres
af noradrenalin. Ud fra studier af muskelcellers optagelse af Na+
og tab af K+ under arbejde definerede Dean i 1941 som den første
Na,K-pumpen ved dens transport af Na+ ud og K+ ind over cellemembranen.
August Krogh studerede allerede i 1938 aktiv transport af NaCl hos
vanddyr og fandt at frøer kunne optage Na+ gennem huden fra
ekstremt fortyndede opløsninger. Hans H. Ussing udviklede
konceptet for aktiv transport med operationel definition af den
aktive transport af Na+ ved flux-tratio for ioner og elektriske
målinger af kortslutningsstrømmen over frøkind.
Digitalisglykosidernes hæmning af pumpen blev beskrevet i
1953 af Schatzmann, der fandt at den koblede transport af Na+ og
K+ i røde blodlegemer blokeres af strofantin. Glynn i Cambridge
og Post på Vanderbilt University i USA studerede Na,K-transport
i røde blodlegemer og Post fandt i 1956 at transport forholdet
var tre Na+ ud og to K+ ind. Det var også kendt fra studier
på frøskind og nerver at den aktive Na,K-transport
var koblet til cellernes produktion af energi, idet den kunne hæmmes
af cyanid og andre metaboliske gifte.
Modtagelsen af Skou’s første artikel 1957 var meget behersket.
Post og Glynn begyndte straks at arbejde med sammenhængen
mellem ATP spaltning og Na,K-transport i røde blodlegemer.
Senere arbejdede Post med de intermediære trin i processen,
især fosforylering fra ATP og defosforylering. Derudover var
der ringe interesse for den nye ATPase aktivitet. Faktisk var der
omkring 1960 større interesse i USA for Hokin’s teori om
fosfatidsyre cyklus som forklaring på Na-pumpen i saltkirtler.
Det var først i 1962-63 at antallet af publikationer om Na,K-ATPase
og Ca-ATPase begyndte at stige væsentligt.
Na,K-pumpens fysiologiske betydning
Da Na,K-pumpen transporterer flere Na+ joner ud end K+ joner
ind i cellen er den elektrogen, d.v.s. at den skaber et elektrisk
potential over membranen med positiv yderside. Potentialet er en
betingelse for at nerveimpulser kan løbe langs nerver og
muskelceller. Pumpen fungerer således som et batteri, der
er forudsætning for dannelse af impulser i centralnervesystemet.
Det er grunden til at hjernen er så følsom for iltmangel,
idet ATP dannelsen ophører og pumpen standser. Det potentiale
Na,K-pumpen skaber er også en forudsætning for opretholdelse
af det normale cellevolumen i alle organismens celler. Hvis pumpen
standser på grund af mangel på ilt og ATP svulmer cellerne.
De Na+ gradienter over membranen, som pumpen vedligeholder, bruges
til sekundært aktiv transport, f. eks. af glukose og aminosyrer
i tarm og nyrer. Na+ gradienterne kan også bruges til transport
af andre joner over cellemembranen. Na+ kan således udveksles
med protoner, H+, ved Na/H-exchange, et system der er vigtigt for
regulation af pH i cellernes cytoplasma. Na+ joner kan også
udveksles med Ca2+ joner, som forlader cellen. Denne mekanisme er
en grund til at digitalis kan styrke hjertets aktivitet, idet hæmning
af Na,K-pumperne betyder at aktiviteten af Ca2+ i cellen øges.
I hvile bruger Na,K-ATPase 15-20% af den producerede ATP mængde,
ca 70 kg per dag, til Na,K-transport i nyrer, centralnervesystem
og organismens øvrige celler, hvor Na,K-gradienter er forudsætning
for opretholdelse af membranpotentiale og cellevolumen.
 |
|
Jens C. Skou i laboratoriet under forsøg
med den renfremstillede Na,K-ATPase
|
En række vigtige stoffer har sideeffekter på Na,K-pumpen.
Insulin og noradrenalin øger K+ optagelsen i muskler og dopamin
hæmmmer Na,K-pumpen i nyren. Den farmakologiske interesse
i Na,K-pumpen er begrænset, måske fordi pumpen er livsvigtig
for alle organismens celler, og ændringer af dens aktivitet
kan have farlige bivirkninger. I modsætning hertil er H,K-pumpen
i mavesækken ikke livsnødvendig, men forudsætning
for at nyde livet med et godt måltid og stoffer, der hæmmer
syresekretionen (ranitidin, cimetidin) eller blokerer H,K-pumpen
totalt (omeprazol, losec), hører til blandt de mest solgte
farmaka.
Jens Chr. Skou som forsker og underviser på universitetet
For at forstå rækkevidden af Skou’s basale opdagelser
og hans usædvanlige bidrag til fysiologi og kemi, er det vigtig
at omtale Skou’s arbejde som forsker og underviser. I slutningen
af 50erne var Aarhus Universitet i en opbygningsfase med 1500-2000
studenter. Skou var lektor i medicinsk fysiologi på et institut
med to amanuenser og en professor der reelt var pensioneret. Skou
holdt de ugentlige forelæsninger i fysiologi over hele Lundsgaards
lærebog over to semestre og han examinerede næsten alle
studerende i fysiologi ved første del. Det var fremragende
undervisning med vægt på de vigtige principper for fysiologiske
funktioner. Skou var ekspert i væske-elektrolyt balance og
arbejdede sammen med den kirurgiske afdeling på Aarhus Kommunehospital
ved etablering af hæmodialyse ved akut anuri og intensiv behandling.
Hvordan var hans holdninger og hvordan arbejdede han på institutet?
Et vigtig vinkel til besvarelse af de spørgsmål er
at kende hans holdning til eksperimenter i laboratoriet. For Skou
betod arbejdet på institutet i at tage en kittel på
og eksperimentere i laboratoriet indtil han blev afbrudt. Det var
hans basale tilstand, men den var ikke en særlig afslappet,
idet han arbejdede med ubrudt energi og betydelig fysisk udfoldelse.
Andre aktiviteter i kontoret, møder, studenter og gæster
var forpligtelser, der afbrød det vigtige, arbejdet med reagensglas,
centrifuger, membranpræparater og måleinstrumenter.
Den ene del af hans laboratorium var organiseret og systematisk,
her arbejdede laborant Inge Raungaard med ATPase assay til katjonkurver
og systematiske målinger af fosforylering og defosforylering
for at opklare Na,K-ATPase reaktionens mekanisme. Den anden del
af laboratoriet var Skous egen, hvor han arbejdede med rastløs
energi og mindre organisation efter en ny opdagelse. For at finde
Skou på institutet behøvede man bare at følge
sporene, en række af brugte reagensglas, centrifugerotorer |
