Fortidens begivenheder ligger begravet i nutidens humane genom
- kan tusind år gammelt DNA fortælle os noget om HIV idag?

Stine Ohlendorff, Klinisk Forsknings Enhed, H:S Hvidovre Hospital og Jesper Eugen-Olsen, Infektionsmedicinsk afdeling, H:S Hvidovre Hospital

Indledning
Siden menneskets oprindelse har evnen til at viderebringe viden været en vigtig faktor for menneskets udvikling. Fra hulemandens tegninger og mundtlige overleveringer viderebragt i skæret fra bålstedet til antropologer og arkæologers retrospektive søgen efter vores oprindelse. Alt med det formål at forklare "hvem vi er, hvorfor vi er og hvor vi kommer fra". På hver sin vis har denne viden bidraget på til det puslespil som danner myten om menneskets historie.

På kanten til det nye årtusind blev molekylær biologien et nyt værktøj til forståelse af sygdomsmekanismer og med potentiale til at forandre vores fælles fremtid. Vores gener fortæller også en historie og bidrager dermed med brikker til det historiske puslespil. Mutationerne spiller en vigtig rolle i menneskets historie på grund af den diversitet der derved er blevet skabt imellem de forskellige befolkningslag. I halvfemserne blev det klart at det oprindelige menneske var fra Afrika. Det betyder at resten af verdens befolkning er udvandret fra Afrika og formodentlig fra det samme område. Begrundelsen for denne antagelse ligger i det faktum, at afrikanere besidder en genetisk variationsrigdom, der overgår alle andre befolkningsgruppers. En sådan hypotese er netop kommet for dagens lys takket være den mulighed der i dag er for at screene DNA. Der ligger uanede mængder oplysninger gemt i det DNA som findes i alverdens fund, af planter, dyr og mennesker. Ved at screene DNA fra oldtidsfund, kan vi på den måde følge historien på et ganske andet plan end tidligere og derved få et større perspektiv på den genetiske mangfoldighed. Og i yderste konsekvens kan vi lære noget om udvikling og selektion til at forudsige den genetiske sammensætning af det fremtidige menneske, som med tiden vil degradere det nutidige menneske til en primitiv forfader.

Det interessante ved at kortlægge fortiden er muligheden for at finde årsager til nutidige fænomener så som udbredelsen af bestemte mutationer og derigennem bidrage til vores historie.

Mutation med positiv effekt
Et eksempel på en mutation der har vakt opsigt på grund af udbredelsesmønstret er CCR5D32, der som navnet antyder er en 32 basepar deletion i kemokin receptor genet CCR5 (1). Denne mutation har vist sig at virke beskyttende overfor HIV-1 infektion, idet HIV-1 benytter denne receptor sammen med CD4 for at kunne trænge ind i en værtscelle (2,3). Afhængig af individets polymorfi med hensyn til CCR5-genet forholder det sig således, at individer heterozygote for mutationen har en længere symptomfri periode fra HIV til AIDS, og individer homozygote for mutationen kan praktisk taget ikke få HIV (4). Denne beskyttende effekt forklares med dannelse af en trunkeret kemokin receptor, der tilbageholdes i det endoplasmatiske retikulum, og derfor kun i sjældne tilfælde når overfladen af cellen (1).

Den langsommere progression til AIDS hos HIV-smittede individer heterozygot for CCR5 D32 er associeret med langsommere fald i CD4-T-celle niveauet og lavere viral replikation (4,5), men effekten er afhængig af den virale tropisme (6). Denne relation ses også afspejlet i det faktum at individer med mutationen sjældent får de følgesygdomme som definerer AIDS-stadiet. Toxoplamosis er en af de første AIDS-definerende sygdomme, som på lige fod med AIDS dementia complex, kun i sjældne tilfælde ses hos individer heterozygote for CCR5 D32 (7,8). Det betyder at et individ heterozygot for CCR5 D32 er delvist beskyttet mod de følgesygdomme som svækker immunforsvaret og efterfølgende gør individet til AIDS-patient.

Geografisk udbredelse af CCR5D32
Udbredelsen af CCR5 D32 mutationen er begrænset til en bestemt del af verdens befolkning. Mutationen findes kun blandt kaukasiere; med størst prævalens i Nordeuropa faldende mod Sydeuropa. Omkring 1-2% af den danske befolkning (ca. 50.000 individer) er homozygote for deletionen og mangler denne overfladereceptor, mens ca. hver fjerde dansker bærer deletionen i heterozygot form. Den høje prævalens af deletionen i Nordeuropas befolkning er sandsynligvis resultatet af en eller flere epidemier forårsaget af en mikrobe der, som HIV, benytter CCR5 i sin livscyklus (9).

Hvad skyldes den høje forekomst af D32 i dagens danskere
Der har været mange spekulationer om forklaringen af det faktum, at CCR5D32 mutationen er så udbredt blandt kaukasiere, mens den ikke findes blandt afrikanere eller asiater. Spekulationer om tidligere HIV epidemier eller epidemier forårsaget af andre patogener med samme infektionsmetode som HIV-1 optager i øjeblikket mange sind.

For at finde en forklaring på CCR5D32 mutationens høje prævalens i Europa, har det været nødvendigt at fastlægge det tidspunkt i historien, hvor mutationen opstod. Der var blandt forskergrupperne enighed om, at mutationen ikke kunne være opstået ved almindelig genetisk drift, men nærmere ved en selektiv udvælgelse af individer bærende denne mutation.

Der er ved hjælp af forskellige metoder gjort flere tiltag for at finde det nøjagtige tidspunkt for mutationens opståen. To uafhængige amerikanske forskergrupper har hver især beregnet på tidspunktet for det selektive pres på mutationen. En gruppe ledet af Frédérick Libert beregnede at mutationen havde et stærkt link til to microsatellitter (IRI3.1 og IRI3.2) med en så høj procentdel at de fleste, hvis ikke alle, CCR5D32 alleler må antages at stamme fra en enkelt mutation for et par tusind år siden (9). En anden gruppe ledet af J.C. Stephens beregnede afstanden mellem markører i genomet og overkrydsningsfrekvensen og kom på den måde frem til at mutationen må have været opstået for omkring 700 år siden (275-1875 år siden) (10).

Selvom der således er enighed mellem de to forskergrupper, er der enighed om at mutationen er opstået inden for de sidste par tusind år. Der er også enighed om at det selektive pres skyldes en eller flere voldsomme epidemier, som skånede de mennesker som var i besiddelse af den positive mutation.

Den sidste datering falder tidsmæssigt sammen med den sorte død, som bredte sig fra Sicilien og op igennem Europa I 1347, for at ramme Skandinavien i 1349-50. Under den sorte død blev omkring 1/3 af Europas befolkning ofre for epidemien. Først i 1870’erne fandt man ud af, at den sorte død skyldes pest bacillen Yersinia pestis, som danner proteinet Yop-1, som inficerer makrofager i blod og organer og dermed svækker immunforsvaret.

Selvom Y. pestis hypotesen er en mulig forklaring, er der nogle brikker som ikke helt falder på plads. Det første kendte udbrud af den sorte død fandt sted i Konstantinopel i 542-43, hvorfra det bredte sig til Frankrig og Spanien, men så vidt vides ikke til Skandinavien, og Y. pestis epidemier i mellemtiden stemmer ikke overens med den højere incidens af D32 i Skandinavien i forhold til Sydeuropa. To amerikanske forskergrupper ledet af henholdsvis Stephen O’Brien og Stan Falkow undersøger i øjeblikket om makrofager, fra individer der enten har eller mangler CCR5, kan inficeres med Y. pestis, M. tuberculosis, L. monocytogenes, samt andre patogene mikroorganismer (personlig kommentar, Nelson L. Michael).

En anden og måske lige så interessant årsag er for nylig fundet. En forskergruppe ledet af Alshad S. Lalani har vist at kanin poxvirus, der er et DNA virus, benytter kemokin receptorer ved infektion af en værtscelle (11). Det sandsynliggør at der var/er andre humant adapterede virus, måske endnu ukendte, der som HIV benytter CCR5 og derved har bidraget (eller bidrager) til det selektive pres på CCR5D32 mutationen.

I kølvandet på interessen for kemokin receptorer i forbindelse med HIV terapi, bliver kemokinerne og deres receptorer til stadighed tillagt flere og flere funktioner. Det kan blandt andet nævnes at kemokiner formodes at dirigere leukocyt migrationen til et inflammatorisk område i forbindelse med allergisk lungesygdom (12). En anden undersøgelse viser, at CCR5D32 mutationen ikke ses homozygot hos individer med astma, men kun heterozygot hos individer med svag form for astma. Derfor kan astma i princippet have bidraget til det selektive pres, som ligger til grund for den høje prævalens for CCR5D32 mutationen (13). Undersøgelsen er dog enkeltstående og det kan diskuteres hvorvidt astma har bidraget til det selektive pres.

Der er altså mange mulige kandidater, men ingen konkret datering til at udelukke de tidsmæssigt urealistiske og dermed indkredse den (de) realistiske kandidat(er).

Dansk molekylær arkæologisk undersøgelse af D32 deletionens opståen
I Klinisk Forsknings Enhed benytter vi den omvendte fremgangsmåde. Ved at benytte arkæologisk materiale forsøger vi, i samarbejde med arkæologer og historikere, at afdække hvilken historisk begivenhed(er) der kunne tænkes at have udøvet det selektive pres ved at analysere DNA fra 14C-daterede knogler.

Vi screener DNA fra 50 til 9250 år gamle knogler, men er særligt interesseret i at undersøge den nok mest markante overgang i Danmarks forhistorie, nemlig overgangen mellem tragtbægerkultur og enkeltgravskultur i yngre stenalder (1800-2600 F.K.).

Tragtbægerkulturen var højt udviklet og det var I den periode at der blev bygget de store gravhøje der stadig præger vores landskab. Endvidere var tragtbægerkulturen kendetegnet ved bygning af langhuse og anvendelse af agerbrug. I den senere enkeltgravskultur erstattedes de store anlæg af små jordhøje eller sekundære begravelser i eksisterende høje. De store huse erstattedes af små huse eller hytter, og landbruget baseredes i højere grad på kvægavl. Denne voldsomme ændring i levevis kunne forklares ved en indvandring af et nyt folkeslag, men kan også forklares ved en stor nedgang i befolkningstallet evt. som følge af en epidemi. Udbredelsen af enkeltgravskulturen, eller snorekeramisk kultur som den hedder i europæisk sammenhæng, i Nord- og Mellemeuropa falder sammen med det fundne højincidensområde for D32-deletionen.

Det er lykkedes os at at extrahere DNA fra de fleste af de knogler vi har til rådighed og DNAet har vist sig at være højmolekylært. De fleste af de prøver vi indtil videre har rådighed over er blevet screenet, men kun 10 er indtil nu blevet polymorfisk bestemt. Når et tilstrækkeligt antal polymorfier er blevet bestemt, vil det være muligt at se et mønster i mutationens forekomst, som kan bruges til datering af dens opståen og datering af det tidspunkt hvor et selektivt pres har skabt en høj prævalens for mutationen.

1. Når en datering foreligger er det efterfølgende muligt at sammenholde dateringen med historiske beskrivelser for på den måde at se, om epidemien kan spores her. En sådan viden kan ikke blot fortælle os om vores historiske aner, men kan også bidrage med en større indsigt i samspillet mellem vært, genetik og mikrober, som kan være til hjælp ved fremtidens epidemier.
2. Liu R, Paxton WA, Choe S, Ceradini D, Martin SR, Horuk R, MacDonald ME, Stuhlmann H, Koup RA, Landau NR. Homozygous defect in HIV-1 coreceptor accounts for resistance of some multiply-exposed individuals to HIV-1 infection. Cell 1996; 86: 367-377.
3. Deng H, Liu R, Ellmeier W, Choe S, Unutmaz D, Burkhart M, Di Marzio P, Marmon S, Sutton RE, Hill CM, Davis CB, Peiper SC, Schall TJ, Littman DR, Landau NR. Identification of a major co-receptor for primary isolates of HIV. Nature 1996; 38: 661-666.
4. Dragic T, Litwin V, Allaway GP, Martin SR, Huang Y, Nagashima KA, Cayanan C, Maddon PJ, Koup RA, Moore JP, Paxton WA. HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5. Nature 1996; 381: 667-673.
5. Eugen-Olsen J, Iversen AK, Garred P, Koppelhus U, Pedersen C, Benfield TL, Sorensen AM, Katzenstein T, Dickmeiss E, Gerstoft J, Skinhøj P, Svejgaard A, Nielsen JO, Hofmann B. Heterozygosity for a deletion in the CKR-5 gene leads to prolonged AIDS-free survival and slower CD4 T-cell decline in a cohort of HIV-seropositive individuals. AIDS 1997; 11: 305-310.
6. Katzenstein T, Eugen-Olsen J, Iversen AK, Garred P, Pedersen C, Benfield TL, Sorensen AM, Koppelhus U, Dickmeiss E, Gerstoft J, Skinhøj P, Svejgaard A, Nielsen JO, Hofmann B. HIV-infected individuals with the CKR5/CKR5 genotype have lower HIV RNA levels and higher CD4 cell counts in the early years of infection than do patients with the wildtype. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 1997; 16: 10-14.
7. Michael NL, Chang G, Louie LG, Mascola JR, Dondero D, Birx DL, Sheppard HW. The role of viral phenotype and CCR-5 gene defects in HIV-1 transmission and disease progression. Nat Med 1997; 3: 338-340.
8. Meyer, L., Magierowska, M., Hubert, J-B., Mayaux, M-J., Misrahi, M., Le Chenadec, J., Debre, P., Rouzioux, C., Delfraissy, J-F., Theodorou, I. CCR5D32 Deletion and Reduced Risk of Toxoplasmosis in Persons Infected with Human Immunodeficiency Virus Type 1. J Infectious Diseases 1999; 180:920-924.
9. Van Rij, R.P., Portegies, P., Hallaby, T., Lange, J.M.A., Visser, J., de Roda Husman A-M., van ´t wout, A.B., Schuitemaker, H. Reduced Prevalence of the CCR5D32 Heterozygous Genotype in Human Immunodifiency Virus-Infected Individuals with AIDS Dementia Complex. J Infectious Diseases 1999; 180:854-857.
10. Libert F., P. Cochaux, G. Beckman, M. Samson, M. Aksenova, A. Cao, A. Czeizel, M. Claustres, C. de la Rua, M. Ferrari, C. Ferrec, et al. The deltaccr5 mutation conferring protection against HIV-1 in Caucasian populations has a single and recent origin in Northeastern Europe. Hum Mol Genet 1998; 7: 399-406.
11. Stephens JC, Reich DE, Goldstein DB, Shin HD, Smith MW, Carrington M, Winkler C, Huttley GA, Allikmets R, Schriml L et al. Dating the origin of the CCR5-Delta32 AIDS-resistance allele by the coalescence of haplotypes. Am J Hum Genet 1997; 62: 1507-1515.
12. Lalani, A.S., Masters J., Zeng W., Barrett J., Pannu R., Everett H., Arendt C.W., McFadden G. Use of Chemokine Receptors by Poxviruses. Science 1999; 286: 1968-1971.
13. Wells T.N.C. and Proudfoot A.E.I. Chemokine receptors and their antagonists in allergic lung disease. Inflamm.res. 1999; 48: 353-362.
14. Hall I.P., Wheatly A., Christie G., McDougall C., Hubbard R., Helms P.J. association of CCR5D32 with reduced risk of asthma. Lancet 1999; 354: 9186.