[BioZoom nr. 3, 1999]

Genomisk imprinting

Morten Lorentz Pedersen, cand. scient. og Karen Brøndum-Nielsen, John F. Kennedy Instituttet

Genomisk imprinting: det nye store dyr i åbenbaringen
Det er vel hørt før i blandt biologer, men - ja - også denne artikels ene forfatter nåede lige akkurat at blive færdig med sin kandidat grad, da ny viden gjorde det nødvendigt at bruge det helt store viskelæder i de for længst uddaterede lærebøger. Genomisk imprinting betyder, at de berørte gener på de autosomale kromosomer er underlagt en form for kontrol, der gør at kun den ene allel er aktiv. Figur 1 illustrerer hvordan antallet af publicerede artikler om imprinting ret pludseligt er skudt i vejret helt uafhængigt af den konstante stigning i det årlige antal publicerede artikler om to af de syndromer, som er sat i forbindelse med imprintede gener i menneskets genom; nemlig Beckwith-Wiedemann syndrom (BWS) og Prader-Willi syndrom (PWS).

Genomisk imprinting har vist sig for alle som arbejder med det at være en formidabel faglig udfordring. Samtidig har selve eksistensen af genomisk imprinting udfordret og udvidet de fundamenter, som moderne genteknologisk forskning og udvikling baserer sig på. Det sidste årtis forskning har vist, at det mammale genom indeholder et lille antal gener, hvis ekspressionen afhænger af den parentale allels herkomst. Antallet af imprintede gener i det mammale genom er estimeret til omkring et par hundrede hvoraf omkring 10% på nuværende tidspunkt er identificeret og beskrevet i litteraturen.

Vi arver alle en allel af hvert gen fra hver af vores forældre og hvis den ene allel ikke virker, kan vi være heldige at den anden gør og at den ikke hæmmes af det ødelagte gen. Hvorfor skulle det nu være nødvendigt at lave om på det? Hvilke konsekvenser må man forudse at det måtte have? Og hvis nucleotidsekvensen på de to alleler i et imprintet gen i øvrigt er ens, hvordan nedarves et imprint så?

Sygdomme hos mennesket hvor imprintede gener har en betydning
Hos mennesket kender man tre syndromer, som med stor sikkerhed involverer imprintede gener: Ud over førnævnte BWS, en tilstand med overvækst, og PWS, et mental retarderingssyndrom med reduceret længdevækst samtidig med hyperfagi og fedme, drejer det sig om Angelman syndrom (AS), som er karakteriseret ved svær mental retardering, ataxi og epilepsi.

Opdagelsen af imprintede gener
Zygoter, som er deriveret fra to pronuclei fra ægceller danner hos pattedyr et partenogenetisk fosteranlæg, hvor der ikke vil være nogen paternelle alleler tilstede. Selve fosteranlægget er næsten normalt, men de ekstraembryonale væv er stærkt underudviklede. En androgenetisk deriveret zygote vil udvikle placenta og hinder, men abnormt underudviklet fosteranlæg.

En af konsekvenserne af tilstedeværelsen af imprintede gener i det mammale genom, er, at det er essentielt at ethvert afkom sikres både et maternelt og et paternelt genetisk bidrag. Man har ment, at fostrets vækst er afhængig af en slags konkurrence mellem paternelle alleler, som er overvejende vækstfremmende, og maternelle alleler, som tenderer til at begrænse fostrets vækst.

Eksperimentelt arbejde har vist at de mekanismer, som er involveret i den manglende levedygtighed af parthenogenoter begrænser sig til visse kromosomer, svarende til, at kun en lille del af genomet er imprintet. Men selv i de tilfælde, hvor der kommer et levedygtigt afkom, fandt B. M. Cattanach og M. Kirk (6) i 1985 for kromosom 2 og 11 i mus, at der kan forekomme fænotypisk let genkendelige effekter ved maternel duplikation kombineret med manglende paternelt bidrag, samt ved den omvendte situation med paternel duplikation uden maternelt bidrag, men at fænotyperne i de to situationer er forskellige!

Uniparentel disomi og genomisk imprinting
Ovenstående fænomen kaldes også for uniparentel disomi eller UPD og kan opstå som følge af sammensmeltning af en disom gamet med en gamet, som er nullisom for det homologe kromosom (7). Hvis fejlen opstår som et resultat af nondisjunktion under meiose I, vil resultatet være en gamet med en allel fra hver af de to homologe kromosomer fra den samme forælder. Sagt på en lidt anden måde vil de to alleler stamme fra hver sin bedsteforælder. Denne situation er defineret som heterodisomi. Hvis fejlen opstår som et resultat af nondisjunktion under meiose II, vil allelerne være identiske, og altså stamme fra de to kromatider fra samme homologe kromosom. Denne situation kendes som isodisomi. I praksis vil hetero- og isodisomi kunne forekomme på det samme kromosom på grund af overkrydsning under meiosen.

UPD behøver ikke at være opstået som følge af sammensmeltningen af en disomisk og en nullisomisk gamet, sådan som Eric Engel foreslog det i 1980 (7), men kan f. eks. opstå ved „trisomy rescue" eller post-zygotisk ved nondisjunktion under mitosen. En nærmere gennemgang falder dog udenfor formålet med denne artikel.

Da disse teorier første gang blev lagt frem af Eric Engel i 1980, var der ingen eksperimentelle eller deskriptive data til understøtte dem og der skulle gå otte år før den første rapport om UPD i et menneske med en euploid karyotype blev offentliggjort (24).

Der kan være flere forskellige konsekvenser af UPD (24), men vigtigst i denne sammenhæng er, at hvis der optræder UPD for et område af genomet som er imprintet, vil der kunne opstå overekspression eller manglende ekspression af et gen, alt efter om der er tale om paternel eller maternel UPD, og om generne i området er udtrykt på den paternelle eller maternelle allel. Dette blev tidligst observeret for PWS i 1989 (20). Ren UPD for kromosom 11p er ikke set i levedygtigt afkom, men kan optræde som en mosaik af normale celler og celler med paternel UPD i patienter med BWS (5).

UPD er blot en af de mekanismer, som kan føre til over- eller underekspression af imprintede gener. Over- eller underskepression af imprintede gener kan også være et resultat af mutation i - eller deletion af - en af de cis eller trans virkende faktorer, som er nødvendig for etableringen eller vedligeholdelsen af imprintet. Ved PWS er der en mangel på/fravær af normalt paternelt udtrykte gener, ved AS er en normal maternel genekspression slået ud. PWS kan fremkomme ved mutation/deletion eller ren UPD af henholdsvis paternelt kromosom 15q11-13 eller maternel UPD 15q11-13. Omvendt kan AS fremkomme ved mutation/deletion eller ren UPD af henholdsvis maternel kromosom 15q11-13 eller paternelt UPD 15q11-13 (3).

Den molekylære virkelighed bag imprintet
Sammenligning af de imprintede gener man kender fra mus og mennesker har afsløret visse fælles træk:

• Imprintede domæner replikeres asynkront, således, at den paternelle allel i FISH forsøg har en tendens til at skilles i dubletter tidligere end den maternelle allel (15).
• Alle imprintede gener indeholder veldefinerede begrænsede områder med allel specifik methylering, som slettes og genetableres kønsspecifikt i gameterne (3).
• Imprintede gener findes ofte i "clusters", f. eks. flere megabase store områder på kromosom 11p15 og 15q11-13, som indeholder såvel maternelt som paternelt udtrykte gener (3).
• Imprintede gener kan kode for både protein og for RNA, som ikke translateres. Som regel indeholder imprintede clusters mindst et imprintet gen, som koder for et ikke-translateret RNA (3).
• For området omkring exon 1 i SNRPN på den paternelle allel (23), og for området 5' for h19 på den maternelle allel (11), har man fundet tydeligt afgrænsede områder, som udviser hypersensitivitet overfor nucleaser. Dette kunne tyde på at strukturelle proteiner, som er involveret i pakningen af DNA’et spiller en eller anden rolle i den række af begivenheder, som tilsammen kan kaldes imprintingsmekanismen. Dette er også blevet verificeret for IGF2 genet ved brug af selektive histon deacetylase inhibitorer (12).
• For tre imprintede gener UBE3A (22), igf2 (19) og KvLQT1 (16) har man fundet imprintet antisense RNA transkripter, som overlapper de respektive gener.
• Man har også for UBE3A (26), IGF2 (29) og KvLQT1(17) fundet vævsspecifik imprinting.
• For to imprintede gener, igf2r (4) og h19 (27), har man påvist eksistensen af de novo methylerings aktivitet i embryo celler og karakteriseret de novo methylerings signalet i det ene tilfælde (4).

Alt dette peger på flere mulige modeller for etablering og vedligeholdelse af imprintet, såvel som det nødvendige "switch", der må finde sted på ny ved passagen af en paternel allel gennem kvindens gametogenese og vice versa. Det må dog formodes at sekvensspecifik de novo methylering og/eller inkorporering/acetylering af strukturelle DNA bindende proteiner spiller en central rolle for etableringen og vedligeholdelsen af imprintet, samt at imprintede antisense RNA transkripter spiller en rolle for regulering af imprintede gener.

Genomisk imprinting - hvorfor?
Zebrafisk har vist sig at kunne give ophav til partenogenetisk afkom som er levedygtigt med en frekvens på 10-20% (28), men hvor i udviklingshistorien genomisk imprinting først dukker op og med hvilken overordnet funktion vides endnu ikke. Der har dog været spekulationer fremme om at genomisk imprinting har været en nødvendig forudsætning for udviklingen af en placenta (9). Eftersom imprintede gener som oftest er forskelligt methylerede på de CpG dinucleotider som findes i og omkring disse gener, de to alleler imellem, har nogle forskere også forestillet sig at genomisk imprinting kunne være udviklet på basis af de systemer i cellen, som er involveret i nedlukningen af fremmede virale gener (2). Endnu en teori går ud på, at imprinting har udviklet sig fra de mekanismer, som er involveret i inaktiveringen af det ene X kromosom i mammale hunlige celler. Sammenlignende genetiske studier af imprintede gener hos pungdyr og eutheriale pattedyr tyder dog på at en sådan udvikling, hvis den har fundet sted, ikke kan være foregået indenfor de seneste 180 millioner år (25). Det man i dag ved om imprintede gener bærer præg af, at det fortrinsvis er i mus og mennesker at dette fænomen er blevet studeret. Derfor kan det være vanskeligt at drage meget generelle konklusioner. Det er heller ikke på forhånd givet at nogle af disse teorier udelukker hinanden, eftersom et sæt af selektionstryk jo kan afløses af et helt andet sæt, som en organisme så må tilpasse sig.

Faktisk er der er nok ingen af de teorier som har været fremført om evolutionen af imprintede gener som giver en tilfredsstillende forklaring af fænomenet ud fra alle de data som findes omkring imprinting, og alene her består der en intellektuel udfordring for de mest snørklede hjerner, men en enkelt teori skal dog fremhæves her.

R. A. McGowan og C. C. Martin (1997) (18) har fremsat følgende interessante teori: Hvor seksuel reproduktion gjorde det muligt for en population at introducere en større genetisk variation end aseksuel reproduktion, kunne imprinting være det næste skridt, som øger muligheden for at genetiske variationer indtræffer samtidig med at selektionstrykket på den ene aktive allel er betydeligt højere end hvis genet ikke var imprintet. Dette passer fint sammen med, at methyleret cytosin, som imprintede gener jo indeholder i rigelige mængder, muterer langt lettere end ikke-methyleret cytosin. For de imprintede gener vil der således være en pool af alleler i en givet population, som nedarves i den imprintede form igennem flere generationer og som derfor ikke falder bort ved naturlig udvælgelse hvis de muterer. For eksempel vil ca. 0,1% af alle imprintede alleler efter 10 generationer ikke være blevet givet videre i aktiv form, og har som konsekvens deraf ikke været testet for funktionalitet i et levende individ i 10 generationer (Se figur 2). Når denne test så sker ved at allelen gives videre i aktiv form kan der nå at være sket langt større ændringer i genet sammenlignet med ikke imprintede gener. Denne teori passer specielt godt for IGF2 og dens receptor IGF2R af to årsager: 1. Muligheden for funktionel coevolution, som i tilfældet med en receptor og dens ligand, må formodes at øges betragteligt af de mekanismer, som er involveret i genomisk imprinting af de årsager, som er nævnt ovenfor. 2. Den observation at IGF2R kun er imprintet i nogle få mennesker kunne antyde muligheden af at genomisk imprinting for det enkelte gen er en slags forstærket evolution, som kommer og går i løbet af udviklingshistorien, og at alle gener derfor i princippet har muligheden for at blive underlagt imprinting.

Forskningen nu og i fremtiden
Hvilken betydning genomisk imprinting har for den igangværende forskning indenfor andre områder er umiddelbar svært at sige noget entydigt om, men der er en stigende forståelse af epigenetiske mekanismers betydning for andre tilstande så som cancer og ældning (13), diabetes mellitus(21),intrauterin vækstretardering (IUGR) (1,10,14), samt indenfor genterapi (8) for blot at nævne de vigtigste.

Referencer

1. S. N. Abu-Amero, Z. Ali, P. Bennett, J. I. Vaughan, G. E. Moore, Mol. Reprod. Dev. 49, 229 (1998).
2. D. P. Barlow, Science 260, 309 (1993).
3. M. S. Bartolomei, S. M. Tilghman, Annu. Rev. Genet. 31, 493 (1997).
4. Y. Birger, R. Shemer, J. Perk, A. Razin, Nature 397, 84 (1999).
5. F. Z. Bischoff, et al, Hum. Mol. Genet. 4, 395 (1995).
6. B. M. Cattanach, M. Kirk, Nature 315, 496 (1985).
7. E. Engel, Am. J. Med. Genet. 6, 137 (1980).
8. M. Fenger, A. A. Vaag, Ugeskrift for læger 161, 3823 (1999).
9. J. D. Gold, R. A. Pedersen, Curr. Top. Dev. Biol. 29, 227 (1994).
10. W. F. Hansen, et al, Prenat. Diagn. 17, 443 (1997).
11. A. T. Hark, S. M. Tilghman, Hum. Mol. Genet. 7, 1979 (1998).
12. J. F. Hu, H. Oruganti, T. H. Vu, A. R. Hoffman, Biochem. Biophys. Res. Commun. 251, 403 (1998).
13. J. P. Issa, P. M. Vertino, C. D. Boehm, I. F. Newsham, S. B. Baylin, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11757 (1996).
14. D. K. Kalousek, et al, Am. J. Hum. Genet. 52, 8 (1993).
15. D. Kitsberg, et al, Nature 364, 459 (1993).
16. M. P. Lee, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 5203 (1999).
17. M. P. Lee, R. Hu, L. A. Johnson, A. P. Feinberg, Nat. Genet. 15, 181 (1997).
18. R. A. McGowan, C. C. Martin, Biochem. Cell Biol. 75, 499 (1997).
19. T. Moore, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 12509 (1997).
20. R. D. Nicholls, J. H. Knoll, M. G. Butler, S. Karam, M. Lalande, Nature 342, 281 (1989).
21. C. Polychronakos, N. Giannoukakis, C. L. Deal, Dev. Genet. 17, 253 (1995).
22. C. Rougeulle, C. Cardoso, M. Fontes, L. Colleaux, M. Lalande, Nat. Genet. 19, 15 (1998).
23. J. Schweizer, D. Zynger, U. Francke, Hum. Mol. Genet. 8, 555 (1999).
24. J. E. Spence, et al, Am. J. Hum. Genet. 42, 217 (1988).
25. R. Toder, S. A. Wilcox, M. Smithwick, J. A. Graves, Chromosome. Res. 4, 295 (1996).
26. T. H. Vu, A. R. Hoffman, Nat. Genet. 17, 12 (1997).
27. P. M. Warnecke, D. Biniszkiewicz, R. Jaenisch, M. Frommer, S. J. Clark, Dev. Genet. 22, 111 (1998).
28. M. Westerfield, The zebrafish book ( University of Oregon Press, Eugene, Oreg. 1990).
29. H. K. Wu, J. A. Squire, Q. Song, R. Weksberg, Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 221 (1997).