[BioZoom nr. 2, 1999]

DNA-chips

Mads Wichmann Mathiessen & Finn Cilius Nielsen Klinisk Biokemisk afdeling , Rigshospitalet

De seneste års medicinske forskning har ført til en meget detaljeret forståelse af sygdomsmekanismerne ved mange almindelige sygdomme. Da den hastige kortlægning af det humane genom samtidigt har skabt en rationel baggrund for bestemmelse af lokalisation og kloningen af humane gener er identifikationen af nye sygdomsgener steget voldsomt. Inden for mikrobiologien ser man sideløbene at påvisningen af naturligt forekommende mutationer i virus og bakterier får stadig større betydning for behandling og vurdering af virulens.

Udviklingen har på dramatisk vis øget behovet for simple metoder til sekvensanalyse og påvisning af mutationer hos både mennesker og mikroorganismer. Med etableringen af GeneChips™ (Affymetrix) - eller høj-densitets-oligonukleotid-gitter-teknologien (1-7) vil disse analyser kunne forenkles betydeligt og molekylærgenetisk diagnostik blive økonomisk og tidsmæssigt tilgængelig. Ligeledes vil udviklingen af ekspressionsanalyse-chips, samt kendskabet til genomiske sekvenser (gær, e.coli, c.elegans) betyde, at man kan analysere overordentligt komplicerede gen-ekspressionmønstre på en eksperimentelt overskuelig måde. (11)

Fremstilling og analyse af DNA-chips
Princippet i DNA-chips er ganske simpelt og baseret på binding (hybridisering) af korte enkeltstrengede DNA molekyler (oligonukleotider) til en komplementær RNA-streng (Fig. 1). Til sekventering eller mutationsundersøgelse isoleres DNA fra væv eller blod. Det område af genomet, man ønsker at undersøge, opformeres med polymerasekædereaktion (PCR), hvorefter det oversættes (transskriberes) til RNA under samtidig indbygning af et fluorochrom i RNA-kæden. Efter fragmentering hybridiseres RNA’et til mange tusinde syntetisk fremstillede oligonukleotider placeret på en mikrochip. Såfremt RNA’et er komplementært til oligonukleotiderne vil det bindes, og fluorochromet detekteres ved en efterfølgende skanning af mikrochippen.

Figur 1: Princippet i GeneChip™ sekventering Ved undersøgelse af et gen for mutationer isoleres først DNA fra blod eller væv. Genet amplificeres ved hjælp af en polymerasekædereaktion (PCR). Der indbygges en T7-RNA polymerasepromotor i PCR produktet således at det kan transskriberes til RNA. Transskriptionen udføres under tilstedeværelse af fluorescensmærkede nukleotider, som bliver indbygget i transskriptet. RNA-transskriptet fragmenteres på tilfældige steder ved opvarmning. Prøven hybridiseres til de komplementære oligonukleotider på DNA-chippen. Oligonukleotiderne i et kvadrat undersøger identiteten af én baseposition. Hver base undersøges med 16 forskellige oligonukleotider, og kvadratet er derfor opbygget af 16 felter. Rækkerne i kvadratet indeholder oligonukleotider, der varierer på en enkelt position således, at man kan undersøge, hvilken af de fire baser der er tale om. Kolonnerne indeholder prober af fire forskellige længder, således at man opnår en tilfredstillende specificitet. Laserscanningen vil afdække hvilke felter på chippen der fluorescerer og i hvilket omfang. På tegningen ses identifikationen af et G (rødt). Aflæsningen, der tager en halv time, er i øjeblikket den begrænsende faktor for detaljegraden af chippen, da nuværende læsere maksimalt kan adskille 20 µm. Adapteret fra Kozal et al., 1996 (4).

GeneChips™ fremstilles ved en kombination af to konventionelle teknikker: Fotokemi og fotolitografi, der benyttes ved produktion af computerchips. (Fig. 2) (1). Oligonukleotiderne opbygges på et keramisk underlag, hvor et ankermolekyle er fastgjort. Ankermolekylet er kemisk blokeret med et fotoreaktivt stof. Ved belysning gøres ankermolekylerne reaktive, så det er muligt at koble et nukleotid (DNA-byggesten).

Nukleotidet er beskyttet af det samme fotoreaktive stof og ved efterfølgende belysning og reaktion med et andet nukleotid er det muligt at opbygge oligonukleotider med en bestemt sekvens. Antallet af felter på chippen bestemmes af de fotolitografiske masker, der kontrollerer belysningen af overfladen. En reaktion tager 15 minutter, så en chip med samtlige mulige 16-mer oligonukleotid-kombinationer kan fremstilles på kun 16 timer. Antallet af forskellige oligonukleotidprober på en chip bestemmes af, hvor finmasket man kan belyse chippen. Den nuværende teknologi tillader inddeling i felter på 20 X 20 µm. En chip har typisk et areal på ca. 1,6 cm² og kan således rumme op til 400.000 forskellige probefelter. Hvert felt indeholder over en million identiske prober.

For at kunne anvende GeneChips™ er det en forudsætning, at man kender dele af sekvensen for det gen man vil undersøge. Afhængigt af formålet med analysen skal der anvendes forskellige kombinationer af prober på chippen. Ved sekventering anvendes en oligonukleotidpopulation, der undersøger samtlige basepositioner i den sekvens man analyserer. Man opbygger typisk fire oligonukleotider, som er identiske undtagen på den position man vil undersøge. For at opnå en høj præcision undersøges hver position yderligere med 4 oligonukleotider af forskellig længde. Hver base undersøges således med 16 forskellige oligonukleotider. Ved kvantitering af genekspression undersøges de relative mængder af mRNA fra forskellige gener. Her rettes kun et mindre antal (40-200) repræsentative oligonukleotider mod hvert genprodukt. Ved sammenligning af 250 gener vil der være behov for cirka 12.500 forskellige oligonukleotider.

Ovenstående teknologi er patenteret af Affymetrix. De andre firmaer der producerer gen-ekspressionschips fremstiller proberne ved at fastgøre kendt enkeltstrenget cDNA til chippen og benytte disse som prober. (11)

Aktuel anvendelse af DNA-Chips
DNA-chips er på nuværende tidspunkt både blevet anvendt til diagnostik og genomforskning samt monitorering af genekspression i væv og celler.

Sekventering - Undersøgelse af mitokondrie-DNA har stor betydning ved komparativ genom-analyse i forbindelse med populationsstudier samt ved diagnostik af sygdomme forårsaget af mutationer i mitokondriegenomet. Anvendelsen af GeneChips™ til sekventering af mitokondrie-DNA illustrerer metodens enorme potentiale (2). Mitokondriegenomet er 16,6 kilobaser stort og kan analyseres ved hybridisering til en chip med 135.000 oligonukleotider. Hele genomet kan sekventeres på et par timer. Til sammenligning kræver det 1-2 dage at sekventere et mitokondriegenom ved traditionelle metoder. Samtidig er prøvebehandling og dataanalyse betydeligt forenklet.

Mutationsdetektion - Selvom enkelte arvelige sygdomme skyldes mutationer med en særlig lokalisering, er mutationer ofte variable fra familie til familie. Ved f.eks bryst- og kolorektalcancer, er der rapporteret flere hundrede forskellige mutationer i adskillige gener. GeneChips™ har været anvendt til identifikation af mutationer i det hyppigste brystcancergen - BRCA1 (3). I en sekvens på 3,45 kilobaser var det muligt at påvise kendte mutationer hos 14 af 15 patienter med et højdensitetsgitter på 96.600 oligonukleotider. Samtidigt fandtes ingen falsk positive i 20 kontrolprøver. Undersøgelsen viser, at det i fremtiden vil være muligt at foretage hurtige og pålidelige analyser af cancergener. Antallet af screeninger for arvelig cancer er stadig moderat (ca. 2-300 i Danmark/år), men vil formentlig stige fremover. Vælger man eksempelvis at foretage p53-mutationsanalyser på en del af de sporadiske cancere, vil prøvetallet kunne nå op på 5-6.000 analyser per år. I denne forbindelse vil indførelsen af GeneChips™ være nødvendig for at sikre en effektiv håndtering af prøverne.

Et andet eksempel hvor brugen af GeneChip™ har vist sig brugbar, er ved påvisning af mutationer i HIV (4). Ved hjælp af 12.224 oligonukleotider er det muligt at analysere 382 basepar af HIV-genomet fra gag via proteasegenet til genet for revers transkriptase. Princippet i analysen er beskrevet i figur 1.

Genekspression - Genomprojekterne vil blandt andet bringe information om menneskets 100.000 gener. Det er dog ikke tilstrækkeligt til at forstå cellulære funktioner og patogenetiske mekanismer. Dertil vil man have brug for information om ekspressionsmønstret af gener i de enkelte væv. Der findes allerede elegante metoder som 2D gel-elektroforese eller differential display, der kan give et indtryk af hvilke gener og proteiner, som er udtrykt i celler og væv. Begge metoder er meget benyttet til videnskabeligt brug, men har endnu ikke fundet en plads i klinikken. På grund af DNA-chips store effektivitet er de attraktive i forbindelse med monitorering af genekspression. I øjeblikket kan DNA-chips analysere op til 40.000 gener på en chip. Dette er nok til at dække alle gærs gener i et forsøg. (8)

Genkortlægning - Det sidste område, hvor DNA-chips teknologien kunne få endog meget stor betydning, er ved kortlægningen af sygdomsgener. Sygdomsgener lokaliseres i mange tilfælde på baggrund af kobling til en kendt markør/polymorfi. Markørundersøgelser er meget tidskrævende - men såfremt man placerer alle kendte markører på en mikrochip vil koblingsundersøgelser i store familier kunne foretages meget hurtigt.

Perspektiver
En vurdering af ovennævnte studier antyder, at DNA-chips fungerer. Hidtil har kun få laboratorier dog haft adgang til fremstilling og brug af DNA-chips, men det forventes, at det allerede vil blive tilgængeligt for en større kreds i løbet af 1999. Firmaet Affymetrix, der blandt andet har udviklet teknologien, sælger allerede GeneChips™ til HIV, p53 og cytochrom p450 analyse. Adskillige andre firmaer har meldt sig på markedet. De fabrikerer dog hovedsageligt ekpressionsanalyse-chips, da industrien generelt er hæmmet af patentrettigheder, som forhindrer andre end Affymetrix i at lave sekventeringschips . Ekspressionanalysechips laves af blandt andre Incyte, Hyseq, Genome Systems Inc, Genometrix og danske Display Systems Biotech (omtalt i Biozoom nr 4 (1998)). (10)

Såfremt metoderne etableres i større omfang kan det få afgørende betydning for organisationen af gendiagnostik i sygehusvæsenet. Hidtil er de fleste genanalyser blevet foretaget på mange forskellige klinisk genetiske eller klinisk biokemiske afdelinger samt enkelte universitetsinstitutter, hvor man har udført relativt få analyser i mindre antal. Får man mulighed for at screene selv store gener for mutationer i løbet af få timer vil gendiagnostik få karakter af almindelig klinisk biokemisk virksomhed og kunne centraliseres og rationaliseres. Samtidig vil lægen få mulighed for at henvise et langt større antal patienter til genanalyser end hidtil. Dybest set bliver omfanget af gendiagnostik måske snarere begrænset af politisk-etiske hensyn end af de tekniske muligheder.

På nuværende tidspunkt fremstilles chips med en maskestørrelse på 20 µm, men inden for kort tid vil man kunne lave masker på 2 µm. En chip på 1,6 cm² vil således kunne rumme 400 millioner forskellige prober. Dette er tilstrækkeligt til at analysere hele den proteinkodende del af genomet. Spørgsmålet er bare om man vil kunne tolke og forstå så stor en informationsmængde. Det vil i mange tilfælde være vanskeligt at afgøre om en sekvensvariation er sygdomsfremkaldende, og gendiagnostik kræver ofte et stort register af supplerende proteinkemiske og molekylærbiologiske undersøgelser. Samtidigt vil det stille strenge krav til specificiteten af teknologien, da selv en fejlrate på få promille vil medføre et ufatteligt stort kontrolarbejde. På trods af disse betænkeligheder vil etableringen af GeneChip™-teknologien være et kæmpe fremskridt for den farmaceutiske industri samt i medicinsk forskning og diagnostik.

Referencer

1. McGall G, Labadie J, Brock P, Wallraff G, Nguyen T, Hinsberg W. Light-directed synthesis of high-density oligonucleotide arrays using semiconductor photoresists. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 13555-60.
2. Chee M, Yang R, Hubbell E, Berno A, Huang XC, Stern D, Winkler J, Lockhart DJ, Morris MS, Fodor SPA. Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science 1996; 274: 610-4.
3. Hacia JG, Brody LC, Chee MS, Fodor SPA, Collins FS. Detection of heterozygous mutations in BRCA1 using high density oligonucleotide arrays and two-colour fluorescence analysis. Nat Genet 1996; 14: 441-7.
4. Kozal MJ, Shah N, Shen N, Yang R, Fucini R, Merigan TC, Richman DD, Morris D, Hubbell E, Chee M, Gingeras TR. Extensive polymorphisms observed in HIV-1 clade B protease gene using high-density oligonucleotide arrays. Nat Med 1996; 2: 753-9.
5. Lockhart DJ, Dong H, Byrne MC, Follettie MT, Gallo MV, Chee MS, Mittmann M, Wang C, Kobayashi M, Horton H, Brown EL. Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays. Nat Biotech 1996; 14: 1675-80.
6. Cronin MT, Fucini RV, Kim SM, Masino RS, Wespi RM, Miyada CG. Cystic fibrosis mutation detection by hybridization to light-generated DNA probe arrays. Hum Mut 1996; 7: 244-55.
7. Shoemaker DD, Lashkari DA, Morris D, Mittmann M, Davis RW. Quantitative phenotypic analysis of yeast deletion mutants using a highly parallel molecular bar-coding strategy. Nat Genet 1996; 14: 450-6.
8. Lipshutz RJ, Fodor SP, Gingeras TR, Lockhart DJ. High density synthetic oligonucleotide arrays. Nat Genet 1999; 21(1 Suppl): 20-4.
9. Cho RJ, Campbell MJ, Winzeler EA, Steinmetz L, Conway A, Wodicka L, Wolfsberg TG, Gabrielian AE, Landsman D, Lockhart DJ, Davis RW. A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Mol Cell 1998; 2(1): 65-73.
10. Service RF. Microchip arrays put DNA on the spot. Science 1998; 282: 396-399.
11. Supplement to Nature Genetics. Nature Gentics 1999; 21(1 Suppl): 1-6